6.2.3 Virus del mosaico del guisante

El virus del mosaico del guisante (CPMV; Comovirus, Comoviridae) es la plataforma más ampliamente estudiada para diversas conjugaciones y aplicaciones biotecnológicas. Es un virus icosaédrico de 30 nm y consta de un genoma bipartito de ARN de sentido positivo y monocatenario, con cada molécula de ARN encapsulada en una partícula separada. La cápside del CPMV está compuesta por 60 copias de cada una de las dos subunidades CP diferentes (denominadas pequeña, de 24 kDa, y grande, de 42 kDa) con simetría icosaédrica pseudo T = 3. Debido a la presencia de la naturaleza altamente simétrica y heteromérica de la cápside, el CPMV proporciona una notable oportunidad para introducir diferencialmente (en posiciones quíntuples o triples o ambas) múltiples tipos de funcionalidades mediante ingeniería genética y química específica con control tanto de la distribución espacial como del grado de multivalencia (Uchida et al., 2007; Young et al., 2008; Steinmetz, 2010; Wen et al., 2016). El CPMV puede purificarse en grandes cantidades a partir de hojas infectadas y es estable en un amplio rango de temperaturas (hasta 60°C) y en el rango de pH de 3,0-9,0 y puede soportar algunos disolventes orgánicos (Steinmetz et al., 2009). Las cápsides del CPMV se utilizan para la inmovilización controlada de enzimas activas. La utilización de la cápside de CPMV para la fabricación templada de nanopartículas metálicas mediante una deposición sin electrodos (ELD) y la mineralización mediante una variedad de procesos permitió la producción de capas finas de metales y aleaciones con un grosor y composición uniformes. Los viriones de CPMV se utilizan como bloques de nanoconstrucción para la construcción controlada de estructuras bidimensionales y tridimensionales mediante un enfoque ascendente, capa por capa (LbL), para posibles aplicaciones como dispositivos nanoelectrónicos o biosensores múltiples electroquímicos (revisado en Culver et al., 2015; Wen et al, 2015a, 2016; Narayanan y Han, 2017a).

Las partículas nativas de CPMV y CPMV derivadas con complejos metálicos de lantánidos resultaron ser seguras y no tóxicas, según los estudios de biodistribución, toxicidad y patología de estas partículas in vivo (Rae et al., 2005; Singh et al., 2007). Se descubrió que el CPMV se asociaba con regiones de inflamación y que inducía la interrupción de la barrera hematoencefálica durante la infección del sistema nervioso central (SNC) en ratones (Shriver et al., 2009). El CPMV con PEGilación superficial ha mostrado una baja inmunogenicidad, y se impidió la internalización en varios tipos de células debido a la reducción de la unión no específica (Raja et al., 2003). Manchester y sus colaboradores descubrieron que el CPMV marcado con fluorescencia tiene una capacidad endógena de ser captado por las células endoteliales vasculares y puede utilizarse como sonda de imagen intravital para visualizar la vasculatura y el flujo sanguíneo a una profundidad de hasta 500 μm durante 72 h en embriones vivos de ratón y de pollo (Lewis et al., 2006). Se descubrió que el CPMV tiene la capacidad natural de unirse a la vimentina superficial, una proteína citoesquelética que modula la arquitectura y la dinámica de las células, y se descubrió que está sobreexpresado en células endoteliales, cancerosas e inflamatorias (Koudelka et al., 2009). La interacción biocompatible y natural con la vimentina y las características de retención del endotelio de CPMV se han explotado aún más para obtener imágenes de la angiogénesis tumoral y la localización de tumores in vivo (Leong et al., 2010; Steinmetz et al., 2011; Yildiz et al., 2011; Wen et al., 2015a).

La superficie exterior de la cápside del CPMV se ha modificado ampliamente utilizando lisina, cisteína, tirosinas y residuos de ácido aspártico y glutámico expuestos de forma natural o por ingeniería genética mediante el uso de métodos de conjugación química estándar y reticuladores de conjugación para unir varios reactivos como las nanopartículas de Au, metilviolonas reactivas, carboxilatos organometálicos de ferroceno, fluoróforos, biotina, cadenas de PEG, derivados de estilbeno, hidratos de carbono, proteínas heterólogas (por ejemplog., holo-transferrina humana, lisozima T4, el dominio LRR de la internalina B y el producto del gen Intron 8 del receptor de tirosina quinasa HER2), anticuerpos, oligonucleótidos, puntos cuánticos semiconductores y fullerenos. La incorporación de aminoácidos no naturales en la cápside del CPMV se llevó a cabo mediante múltiples químicas ortogonales (como la estrategia de ligadura quimioselectiva de hidrazona y la reacción de cicloadición azida-alquina catalizada por cobre (CuAAC) o «click»). Estos esfuerzos han facilitado el uso de partículas de CPMV como sondas ópticas, candidatos a vacunas y nanodispositivos de memoria y sensores (revisados en Young et al., 2008; Destito et al., 2009; Grasso y Santi, 2010; Steinmetz, 2010; Lomonossoff y Evans, 2011; Wen et al., 2015a; Zhang et al., 2016; Lee et al., 2016b; Narayanan y Han, 2017a). Los CPMV y TMV se cargaron para transportar agentes de contraste para la obtención de imágenes de resonancia magnética (RM) y óptica de doble modalidad, y ambas modalidades demostraron la especificidad de la unión de la fibrina in vitro con la presencia de péptidos de orientación. Los estudios preclínicos en un modelo de lesión fotoquímica de la arteria carótida confirmaron la localización del trombo por parte de las nanosondas, y las varillas alargadas de TMV mostraron una adhesión significativamente mayor a los trombos que las CPMV icosaédricas (Wen et al., 2015b,c). El CPMV decorado con péptidos E7p72 (péptido de unión al factor de crecimiento epidérmico similar al 7 (EGFL7) de alta afinidad que se dirige específicamente a las células endoteliales humanas) se dirigió a la neovasculatura asociada a los tumores con alta especificidad, según se evaluó mediante imágenes intravitales (Cho et al., 2017).

Los protocolos de ensamblaje in vitro e in vivo de las subunidades de la cápside del CPMV aún no están bien establecidos. Esto ha limitado su potencial de uso como nanocontenedor para encapsular moléculas de carga. El contenido de ácido nucleico nativo de los viriones del CPMV se utilizó como esponja electrostática para atraer agentes de imagen y moléculas terapéuticas mediante una sencilla técnica de infusión (Yildiz et al., 2013). La coexpresión transitoria del precursor del CPMV (VP60), que consiste en proteínas grandes y pequeñas fusionadas, y la proteinasa 24K para el procesamiento proteolítico del VP60 en las plantas dio lugar a las VLP del CPMV (eCPMV), que estaban completamente desprovistas de ARN (tanto del virus como del huésped) (Saunders et al., 2009). Estas cápsides vacías se han utilizado para transportar una amplia gama de moléculas de carga, como metales, tintes fluorescentes o fármacos (Culver et al., 2015; Wen et al., 2015a; Narayanan y Han, 2017a). Los fluoróforos, las etiquetas de afinidad de biotina, el PEG y varios péptidos se han mostrado de forma selectiva en la superficie interior del eCPMV apuntando a lisinas reactivas (Wen et al., 2012b). La eficacia del eCPMV como vacuna in situ se demostró en modelos de ratón de melanoma metastásico, cáncer de mama, cáncer de ovario y cáncer de colon, en los que indujo una respuesta inmunitaria antitumoral al desencadenar la activación y la infiltración de neutrófilos, dando lugar a un perfil de quimio/citocinas que conduce a la activación de la inmunidad adaptativa. La mayoría de los ratones a los que se les volvieron a aplicar tumores en el flanco opuesto rechazaron por completo el tumor reimplantado (Lizotte et al., 2016). La administración intratumoral de nanopartículas magnéticas (mNP) para inducir hipertermia y eCPMV en combinación mejoró la eficacia del tratamiento tumoral local y sistémico (retraso del crecimiento tumoral secundario (efecto abscópico) y la resistencia a la reexposición del tumor) en los modelos de adenocarcinoma mamario de ratón C3H/MTG-B y de células de melanoma de ratón C57-B6/B-16-F10 (Hoopes et al., 2017a). Utilizando ocho cánceres caninos espontáneos (dos melanomas orales, tres amelioblastomas orales y un carcinoma), Hoopes et al. (2017b) demostraron que la radiación hipofraccionada y la hipertermia inducida por mNP y el tratamiento intratumoral con eCPMV en combinación demostraron provocar respuestas inmunitarias mejoradas.

Para utilizar la CPMV para la entrega dirigida de fármacos a las células cancerosas y para superar la interacción natural entre la CPMV y las células de mamíferos, se utilizó una reacción «clic» para conjugar el PEG y la fracción de ligando de folato (CPMV-PEG-FA) con la CPMV. Esta conjugación permitió la orientación específica del CPMV a los receptores de folato (FR) que expresan las células HeLa y KB (Destito et al., 2007). La orientación de la CPMV a las células tumorales de neuroblastoma se logró modificando genéticamente la CPMV para mostrar el análogo del neuropéptido Y (NPY) como ligando de orientación. Se demostró que el CPMV-NPY interactuaba específicamente con las células SK-N-MC que sobreexpresaban el receptor Y1 (Destito et al., 2009; Ma et al., 2012). La obtención de imágenes dirigidas a los receptores se logró mediante el anclaje de secuencias peptídicas cortas (F56 y bombesina específicas del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular-1 (VEGFR-1)) y de los receptores del péptido liberador de gastrina (GRPR), respectivamente, a la CPMV. Se comprobó que estos sensores basados en CPMV son específicos para unirse a las células cancerosas que sobreexpresan estos receptores en la superficie celular (Brunel et al., 2010; Steinmetz et al., 2011). Wen y Steinmetz (2014) desarrollaron un enfoque ascendente para la síntesis de nanopartículas, dímeros y ensamblajes de CPMV que contienen ligandos de orientación (péptidos RGD cíclicos), y tintes fluorescentes, y descubrieron que la presentación simétrica de los péptidos RGD y la dimerización de las nanopartículas aumentaban la eficacia de la orientación a las células cancerosas.

CPMV se ha utilizado con éxito para la visualización de varios péptidos heterólogos para inducir la respuesta inmune. La inmunización de animales con cada una de las quimeras indujo una fuerte respuesta inmunitaria humoral que fue protectora contra el desafío del patógeno respectivo. La visualización multivalente de moléculas antivirales y carbohidratos en CPMV facilitó su uso para aplicaciones terapéuticas (Lomonossoff y Evans, 2011; Koudelka et al., 2015; Hefferon, 2017). Aljabali et al. (2013) establecieron la conjugación covalente de dox con CPMV mediante un enlace amida o un puente disulfuro utilizando residuos de lisina o cisteína en la superficie externa de la CPMV. La CPMV cargada de dox mostró un mayor efecto de eliminación de células que la dox libre, incluso a dosis bajas. La CPMV modificada con una corona de dendrones cargados negativamente se utilizó para cargar fotosensibilizadores cargados positivamente (para la terapia fotodinámica (PDT)). Este sistema portador híbrido PDT-CPMV fue eficaz para eliminar tanto las células de melanoma como los macrófagos in vitro (Wen et al., 2016). Para superar las toxicidades inespecíficas limitantes de la dosis de cromo trivalente (un nutriente mineral beneficioso), que puede inhibir selectivamente la proliferación de las células del músculo liso de la aorta humana (HASMC) inducidas por la alta glucosa in vitro, se cargó cloruro de cromo en la cavidad interior del CPMV mediante infusión, y las partículas resultantes del CPMV cargadas de CrCl3 (CPMV-Cr) redujeron significativamente la proliferación de HASMC inducida por la glucosa y presentaron efectos antiaterogénicos en condiciones de hiperglucemia (Ganguly et al., 2016).