La interacción de los rayos X con los electrones de un cristal da lugar a un patrón de difracción, que matemáticamente es la transformada de Fourier de la distribución de la densidad de electrones. Los detectores utilizados para medir los rayos X, sin embargo, sólo pueden medir la amplitud de los rayos X difractados; los cambios de fase, que son necesarios para utilizar la transformada de Fourier y encontrar la distribución de la densidad de electrones, no son medibles directamente utilizando este método. Esto se conoce en la comunidad física como el «problema de la fase». En términos más sencillos, las fases no se pueden encontrar a partir de las amplitudes medidas de los rayos X. Hay que hacer otras extrapolaciones y realizar experimentos adicionales para obtener un mapa de densidad de electrones. Muchas veces, los datos existentes sobre las propiedades físicas y químicas del compuesto pueden ayudar cuando hay un mapa de densidad pobre. Otro método conocido como Síntesis de Patterson es muy útil para averiguar una estimación inicial de las fases y es muy útil para las etapas iniciales para determinar la estructura de las proteínas cuando no se conocen las fases. El problema se puede simplificar encontrando un átomo, normalmente un metal pesado, utilizando la Síntesis de Patterson y luego utilizando la posición de ese átomo para estimar las fases iniciales y calcular un mapa de densidad electrónica inicial que puede ayudar aún más en el modelado de la posición de otros átomos y mejorar la estimación de la fase aún más. Otro método es el llamado Reemplazo Molecular, que localiza la ubicación de la estructura de la proteína en la célula. Además del método de reemplazo molecular, el problema de fase también puede ser resuelto por el método de reemplazo isomorfo, el método de difracción anómala de múltiples longitudes de onda, el método de difracción anómala de una sola longitud de onda y los métodos directos.

Reemplazo MolecularEditar

El problema de fase puede ser resuelto teniendo un modelo atómico que pueda calcular las fases. Se puede obtener un modelo si se conoce la estructura de la proteína relacionada. Sin embargo, para construir este modelo atómico, es necesario determinar la orientación y la posición del modelo en la nueva celda unidad. Aquí es cuando entra en juego la técnica del reemplazo molecular (o MR).

El reemplazo molecular, también conocido como MR, es un método para resolver problemas de fase en la cristalografía de rayos X. El MR localiza la orientación y la posición de una estructura proteica con su celda unitaria, cuya estructura proteica es homóloga a la estructura proteica desconocida que hay que determinar. Las fases obtenidas pueden ayudar a generar mapas de densidad de electrones y ayudar a producir intensidades calculadas de la posición del modelo de la estructura de la proteína a las estructuras observadas del experimento de cristalografía de rayos X.

El método de RM es también efectivo para resolver estructuras cristalinas macromoleculares. Este método requiere menos tiempo y esfuerzo para la determinación estructural, ya que no es necesario preparar derivados de átomos pesados ni recoger datos. El método es directo y la construcción del modelo se simplifica porque no necesita el rastreo de cadenas.

Este método consta de dos pasos:

1. una búsqueda rotacional para orientar el modelo homólogo en la celda unidad o objetivo
2. un objetivo traslacional donde se posiciona el nuevo modelo orientado en la celda unidad

Edición basada en Patterson (reemplazo molecular)

Los mapas de Patterson son mapas vectoriales interatómicos que contienen picos para cada átomo relacionado en la celda unidad. Si los mapas de Patterson se generaron basándose en los datos derivados de los mapas de densidad electrónica, los dos mapas de Patterson deberían estar estrechamente relacionados entre sí sólo si el modelo está correctamente orientado y colocado en la posición correcta. Esto nos permitirá inferir información sobre la ubicación de la estructura proteica desconocida con su célula. Sin embargo, hay un problema con el reemplazo molecular, tiene seis dimensiones, tres parámetros para especificar la orientación y la posición. Con los mapas de Patterson, se puede dividir en subconjuntos de los parámetros para mirar cada parte por separado.

Función de rotaciónEditar

La función de rotación tiene vectores intramoleculares que sólo dependen de la orientación de la molécula y no de su posición porque incluso cuando la molécula se traslada en la celda unitaria, todos los átomos se desplazan en la misma cantidad pero los vectores entre los átomos son los mismos. El mapa de Patterson para la estructura de la proteína desconocida se compara con la estructura de la proteína homóloga conocida en diferentes orientaciones

Función de rotación clásicaEditar

Para encontrar la orientación, determine el eje de rotación y el ángulo de rotación alrededor de ese eje. Se necesitarán dos parámetros para definir un eje (un vector desde el centro de la esfera a un punto de la superficie de la esfera). El eje de rotación comienza paralelo al eje z y se gira alrededor del eje y con un ángulo ᶱ, luego el objeto gira alrededor del eje z con un ángulo ᶲ, y finalmente gira alrededor del eje de rotación con un ángulo ᵠ. Estos especifican un punto en la superficie de una esfera unitaria.

Función de rotación rápidaEditar

La función de rotación se puede calcular comparando dos mapas de Patterson o los picos de esos Pattersons. La función de rotación puede calcularse mucho más rápido con las transformadas de Fourier sólo si los Patterson se expresan en términos de armónicos esféricos.

Función de rotación directaEditar

En la función de rotación directa, la estructura de la proteína puede colocarse en la celda unitaria de la estructura desconocida y el Patterson de la molécula orientada se compara con el Patterson de toda la estructura desconocida.

Función de traducciónEditar

Una vez que se conoce la orientación de la estructura conocida su modelo (mapa de densidad de electrones) puede ser orientado para calcular los factores de estructura donde se utiliza una función de correlación para determinar el vector para traducir el modelo sobre el homólogo dentro de una unidad asimétrica.

Con los modelos de fase orientados y traducidos correctamente de la estructura de la proteína, es lo suficientemente preciso para derivar los mapas de densidad de electrones de las fases derivadas. Los mapas de densidad de electrones pueden utilizarse para construir y refinar el modelo de la estructura desconocida.

Difracción anómala de múltiples longitudes de ondaEditar

Los rayos X se generan en grandes máquinas llamadas sincrotrones. Los sincrotrones aceleran los electrones hasta casi la velocidad de la luz y los hacen viajar a través de un gran anillo poligonal metálico hueco. En cada esquina, los imanes doblan el flujo de electrones, provocando la emisión de energía en forma de radiación electromagnética. Como los electrones se mueven a la velocidad de la luz, emiten rayos X de alta energía.

Las ventajas de utilizar sincrotrones es que los investigadores no tienen que cultivar múltiples versiones de cada molécula cristalizada, sino que sólo cultivan un tipo de cristal que contiene selenio. De este modo, pueden ajustar la longitud de onda para que coincida con las propiedades químicas del selenio. Esta técnica se conoce como difracción anómala de longitudes de onda múltiples. A continuación, los cristales se bombardean varias veces con longitudes de onda de diferentes longitudes, y finalmente surge un patrón de difracción que permite a los investigadores determinar la ubicación de los átomos de selenio. Esta posición puede utilizarse como referencia o marcador para determinar el resto de la estructura. Los beneficios de esto permiten a los investigadores recoger sus datos mucho más rápidamente.

Método de sustitución isomorfaEditar

Este método compara los patrones de difracción de rayos X entre el cristal de la proteína original y el mismo tipo de cristal con una adición de al menos un átomo con alto número atómico. El método fue utilizado para determinar la estructura de pequeñas moléculas y eventualmente la de la hemoglobina por Max Ferdinand Perutz (1914-2002). Un isomorfismo perfecto es cuando el cristal original y su derivado tienen exactamente la misma conformación de la proteína, la posición y orientación de las moléculas y los parámetros de la celda unitaria. La única diferencia que tienen el cristal y su derivado en un isomorfismo perfecto son las diferencias de intensidad debidas a la adición de átomos pesados en el derivado. Estas diferencias pueden identificarse manualmente o mediante un procedimiento automático de búsqueda de Patterson, como SIR 2002, SHELXD, nB y ACORN, y dicha información es importante para determinar los ángulos de fase de la proteína. Sin embargo, el isomorfismo perfecto difícilmente ocurre debido al cambio en las dimensiones de la célula. Para la proteína con átomo pesado, su cambio tolerable en la dimensión de la celda es dmin/4, ya que dmin es el límite de resolución. Otros factores, como la rotación, también contribuyen al no isomorfismo.

ProcedimientosEditar

1. Prepare unos cuantos derivados de la proteína en estructura cristalina. A continuación, medir la dimensión de la celda para comprobar el isomorfismo.
2. Recoger los datos de intensidad de rayos X de la proteína original y su derivado.
3. Aplicar la función Patterson para determinar las coordenadas del átomo pesado.
4. Refinar los parámetros del átomo pesado y calcular el ángulo de fase de la proteína.
5. Calcular la densidad de electrones de la proteína.

Los derivados se realizan mediante dos métodos diferentes. El método preferido consiste en sumergir el cristal de proteína en una solución de composición idéntica a la del licor madre, pero con un ligero aumento de la concentración del precipitante. Otro método es la cocristalización, pero no se suele utilizar porque el cristal no crece o crece de forma no isomorfa. El procedimiento de remojo depende de la anchura de los poros del cristal. Los poros deben ser lo suficientemente amplios para que el reactivo se difunda en el cristal y alcance los sitios reactivos en la superficie de todas las moléculas de proteína en el cristal.

Método de Difracción Anómala de Longitudes de Onda MúltiplesEditar

La Difracción Anómala de Longitudes de Onda Múltiples (abreviada MAD) es un método utilizado en cristalografía de rayos X que permite determinar las estructuras de macromoléculas biológicas, como proteínas y ADN, para resolver el problema de fase. Los requisitos para la estructura incluyen átomos que provocan una dispersión significativa de los rayos X; en particular, el azufre o los iones metálicos de las metaloproteínas. Dado que el selenio puede sustituir al azufre natural, es el más utilizado. El uso de esta técnica facilita enormemente al cristalógrafo el uso del método de Reemplazo Isomorfo Múltiple (MIR), ya que la preparación de compuestos pesados es superflua.

Este método se utiliza para resolver problemas de fase, cuando no se dispone de datos relativos a la difracción dispersa además de las amplitudes. Además, se utiliza cuando un átomo de metal pesado ya está unido dentro de la proteína o cuando los cristales de la proteína no son isomorfos, lo que es inadecuado para el método MIR. El método se ha utilizado sobre todo para la solución de metales pesados, estos metales normalmente provienen de la primera serie de transición y sus vecinos. es importante tener una fuente de campo magnético potente para llevar a cabo este experimento, se debe considerar un entorno como el subterráneo. También se requiere un acelerador de partículas llamado sincrotrón para el método.

Método de difracción anómica de longitud de onda únicaEditar

En comparación con la difracción anómica de longitud de onda múltiple (MAD), la difracción anómica de longitud de onda única (SAD) utiliza un único conjunto de datos de una sola longitud de onda. La principal diferencia beneficiosa entre MAD y SAD es que el cristal pasa menos tiempo en el haz de rayos X con SAD, lo que reduce el daño potencial de la radiación a la molécula. Además, como SAD utiliza sólo una longitud de onda, es más eficiente en cuanto a tiempo que MAD.

Los mapas de densidad de electrones derivados de los datos de difracción anómala de una sola longitud de onda necesitan sufrir modificaciones para resolver las ambigüedades de fase. Una técnica de modificación común es el aplanamiento de disolventes, y cuando el SAD se combina con el aplanamiento de disolventes, los mapas de densidad de electrones que resultan son de calidad comparable a los que se derivan de la fase MAD completa. El aplanamiento del disolvente implica el ajuste de la densidad electrónica de las regiones intersticiales entre las moléculas de proteína ocupadas por el disolvente. Se supone que la región del disolvente está relativamente desordenada y sin características en comparación con la proteína. El suavizado de la densidad de electrones en las regiones del disolvente aumentará la densidad de electrones de la proteína hasta un grado interpretable. Este método se denomina ISAS, dispersión anómala iterativa de longitud de onda única.

Métodos directosEditar

El método directo puede ayudar a recuperar las fases utilizando los datos que obtiene. El método directo estima las fases iniciales y de expansión utilizando una relación triple. La relación triple (trío) es la relación de la intensidad y la fase de una reflexión con otras dos intensidades y fases. Al utilizar este método, el tamaño de la estructura de la proteína es importante, ya que la distribución de la probabilidad de la fase es inversamente proporcional a la raíz cuadrada del número de átomos. El método directo es la técnica más útil para resolver problemas de fase.