Bases estructurales del mecanismo de acción

El ARNr 16S de Escherichia coli está bien estudiado entre las subunidades del ARNr y, en particular, se han analizado las interacciones de varios antibióticos aminoglucósidos con el ARNr 16S y sus efectos en el proceso de traducción del ARNm en polipéptido (35). Existen estructuras de ARNr similares en otros organismos, como la levadura y la Tetrahymena (33). El tratamiento del ARNr con un aminoglucósido protege a varias bases nucleicas del ARNr de la modificación química, lo que implica que estas moléculas poseen una gran afinidad por ciertos sitios del ARNr. Este modo de unión fue comparado por Noller (35) con el de los inhibidores de enzimas, que normalmente se unen a los sitios activos de las enzimas e interfieren con sus actividades. Diferentes clases de antibióticos aminoglucósidos se unen a diferentes sitios del ARNr, dependiendo de la complementariedad estructural entre ambos. Por ejemplo, se cree que la neomicina, la paromomicina (Fig. 1), la gentamicina y la kanamicina se unen al sitio A del ARNr 16S en E. coli de forma similar y se ha demostrado que protegen las bases A1408 y G1494 en experimentos de huella química (Fig. 2) (33). Cuatro bases, A1408, A1492, A1493 y G1494, en el sitio A del ARNr interactúan con el ARNt, aunque con diferentes afinidades. La unión de los aminoglucósidos mencionados al sitio A en la región de decodificación (es decir, el sitio de reconocimiento del codón y del anticodón) interfiere con el reconocimiento preciso del ARNt afín por parte del ARNr durante la traducción (35). Se cree que estas interacciones también interfieren en la translocación del ARNt desde el sitio A al sitio del peptidil-ARNt (sitio P).

Puglisi y colaboradores (12-14, 39) recientemente proporcionaron evidencia estructural sobre el modo de interacciones de la paromomicina, un aminoglucósido representativo de la clase de la neomicina, con una plantilla de ARN de 27 nucleótidos que fue diseñada para imitar la región del sitio A del ARNr 16S en E. coli (Fig.3A). El diseño de la plantilla de ARN se basó en el conocimiento previo de que la paromomicina interactúa con el par de bases C1407 – G1494, A1408, A1493 y U1495 y que estas bases son absolutamente necesarias para la unión de alta afinidad (39) (mostradas en gris en la Fig. 3A). También son importantes otras características estructurales, como el bolsillo creado por la asimetría en la región del bucle interno debido a la presencia de A1492 y el emparejamiento de bases C1409 – G1491 en la región inferior del tallo. Estas características estructurales crean colectivamente un bolsillo que es óptimo para la unión de la paromomicina (véase más adelante).

En la plantilla nativa de ARN del sitio A, el tallo tiene interacciones de emparejamiento de bases en U1406 – U1495 (no canónico) y C1407 – G1494 (Fig 3A). Tras la unión de la paromomicina, la estructura distinta formada por A1408, A1492 y A1493 se estabiliza (Fig. 2B) y las bases A1408 y A1493 forman un par de bases no canónico (12, 39). El nucleótido A1492, que no tiene ninguna interacción de emparejamiento de bases, crea un pliegue en la estructura del ARN, y los efectos combinados de A1492 y el par de bases A1408 – A1493 crean una protuberancia en el sitio A donde la paromomicina se une y amplía aún más el ángulo del pliegue (Fig.2B). Los grupos funcionales de la paromomicina, como los grupos hidroxilo y amino, participan en interacciones específicas con la molécula de ARN (véase más adelante).

El bolsillo creado por A1492 y el par de bases A1408 – A1493 está ocupado por el anillo II de la paromomicina, y este anillo se apila por encima de la base G1491 (mostrado por una flecha amarilla en la Fig. 2B) (12). El anillo I de la paromomicina hace contactos específicos con los pares de bases «universalmente» conservados U1406 – U1495 y C1407 – G1494 en el ARNr. Cabe destacar que el anillo I es absolutamente necesario para la unión específica de los antibióticos aminoglucósidos al ARNr. Los anillos III y IV de la paromomicina extienden estas interacciones más allá del surco principal del ARNr. Los restos de amino e hidroxilo contribuyen principalmente a las interacciones no específicas de la paromomicina con el ARNr; por lo tanto, no son interacciones dependientes de la secuencia. Otro punto importante es que el par de bases C1409 – G1491 proporciona el asiento para la unión del aminoglucósido en el bolsillo, y un par de bases mal emparejadas en esta posición resulta en la pérdida de la unión (12). En general, los aminoglucósidos que comparten características estructurales con la paromomicina se unen al ARNr de forma similar (13). Sin embargo, diferentes antibióticos aminoglucósidos parecen unirse al mismo sitio de unión en más de una conformación (28). En esencia, la conformación del aminoglucósido que se une al ARN debe satisfacer las restricciones electrónicas y estéricas del sitio de unión. En otro estudio sobre el complejo de gentamicina Cla y la plantilla de ARN del sitio A, los anillos I y II de la gentamicina Cla (que son similares a los de la paromomicina) mostraron interacciones de unión similares a las del complejo de paromomicina y la plantilla de ARN del sitio A (57). Sin embargo, el anillo III de la gentamicina Cla interactúa con los pares de bases U1406 – U1495 y G1405 – C1496 en la región del tallo superior (Fig. 3A). A partir de estas observaciones, Puglisi y colaboradores (57) propusieron que todos los aminoglucósidos que se dirigen al sitio A del ARNr 16S se unen de una manera común, similar a los anillos I y II en paromomicina y gentamicina.

Aunque la estructura general del ARNr se conserva entre todas las especies en un sentido evolutivo, existen diferencias que hacen que la unión de los aminoglucósidos sea más específica -por lo menos con una afinidad 10 veces mayor- al ARNr de procariotas que al de eucariotas (19, 35, 38). Esta no es una gran diferencia en la afinidad de unión y puede explicar en parte los efectos tóxicos de estos antibióticos en los sistemas de mamíferos. El ARNr eucariótico contiene una guanina en lugar de A1408, lo que da lugar a un par de bases G1408 – A1493. Además, el par de bases coincidente en C1409 – G1491 no existe en los eucariotas. Estas diferencias dan como resultado una menor afinidad de los aminoglucósidos por el ARNr eucariótico (12, 19, 35, 38). Habiendo esbozado estas diferencias, la unión de los aminoglucósidos al sitio A del ARNr en procariotas altera la conformación del sitio A y afecta a las interacciones específicas del ARNm y el ARNt en este sitio, lo que da lugar a interacciones erráticas codón-anticodón. Hasta la fecha hay poca información estructural sobre los detalles de estas interacciones a nivel ribosómico (véase más adelante), pero la consecuencia clara y última es la interrupción del proceso de traducción.

Se realizó otro estudio estructural sobre la unión de la tobramicina (Fig.1) a un aptámero de ARN (23). El aptámero de ARN que se utilizó en este estudio era un ARN de bucle de tallo de 26 nucleótidos (Fig. 3B). En este aptámero de ARN hay cuatro pares de desajustes, U7 – G20, G8 – U19, G9 – A18 y U11 – U16, que forman parte del bucle de horquilla con cremallera. La tobramicina se une en este surco parcialmente encapsulado por la superficie del surco profundo y la base de guanina del residuo G15 (Fig. 4). En este complejo, el anillo I de la tobramicina se sitúa en el suelo del surco profundo. Uno de los grupos aminos del anillo II de la tobramicina interactúa con la columna vertebral del fosfato en el surco profundo, y el otro grupo amino está expuesto al disolvente. El anillo III se sitúa en el centro del surco profundo, con los grupos hidroxilos dirigidos hacia el suelo del surco. Se ha sugerido que la conformación del aptámero de ARN descrito anteriormente es similar a la de los bucles de horquilla en el ARNt y el ARNr (23).

La estructura de rayos X de 7,5-Å de resolución del complejo funcional deT. thermophilus 70S rRNA que contiene tRNA y mRNA es útil para poner la discusión anterior en perspectiva (5). A partir de esta estructura, uno podría imaginar lo bien que encajarían los estudios de modelos con plantillas de ARN más pequeñas, como el aptámero de tobramicina-ARN y el ARN del sitio A con paromomicina (véase más arriba) en la estructura completa del ARNr. El sitio A en la subunidad 16S del ARNr 70S se ve cerca de la interfaz del ARNt y la subunidad 50S del ARNr, en la proximidad del par codón-anticodón (Fig. 2A). Al comparar la estructura en solución de la plantilla de ARN del sitio A con el sitio A en la estructura de rayos X del ARNr 70S, la estructura de rayos X parecía estar estrechamente relacionada con la plantilla de ARN unida a la paromomicina, pero no con la estructura en solución nativa de la plantilla de ARN del sitio A (5). Esto es intrigante y sugiere que tal vez en la forma funcional la protuberancia o torcedura cerca de las bases A1492 y A1493 siempre existe en el ARNr 70S. Si esto fuera cierto, implica que el bolsillo de unión para la paromomicina ya existe cuando el ARNr 70S se vuelve funcional; por lo tanto, está predispuesto para la inhibición por la paromomicina. Esto contradice la afirmación de que la unión de la paromomicina incrementa el ángulo de giro en el sitio de unión. Las pruebas que apoyan esta idea provienen de un estudio reciente que sugiere que las afinidades de los diferentes aminoglucósidos por la plantilla de ARN del sitio A son diferentes, y la capacidad de estos antibióticos para inhibir la síntesis de proteínas in vitro también varía (15). La gentamicina y varios otros antibióticos relacionados interactúan con el ARN del sitio A con constantes de disociación (Kd) en el rango micromolar, pero inhibieron un proceso de traducción in vitro, con concentraciones inhibitorias del 50% en el rango nanomolar (15). Este último hallazgo se dedujo como resultado de la unión del aminoglucósido al ARNr intacto en la región de decodificación (sitio A), y la diferencia en la unión al ARNr intacto frente a la del ARN molde del sitio A puede deberse a las diferencias en las conformaciones de estos dos ARN, como se ha comentado anteriormente.

El sitio A hace contactos débiles con el ARNm y el ARNt, lo que implica que esta región desempeña un papel en el reconocimiento del ARNt apropiado a través de cambios sutiles en la energía libre (5). La unión del aminoglucósido cerca de este sitio puede afectar al delicado proceso de interacciones entre el codón y el anticodón. También se ha propuesto que la presencia de un aminoglucósido estabiliza el complejo de ARNm y ARNt en el sitio A, lo que a su vez afecta al proceso de traducción (5). Es difícil conjeturar todos los efectos de los aminoglucósidos en la estructura del ARNr, y más estudios estructurales con los aminoglucósidos unidos a los complejos, como el ARNr 70S, serán útiles para dilucidar y comprender los cambios sutiles que conducen a las acciones antibióticas de los aminoglucósidos.

Una serie de investigaciones han utilizado sondas sintéticas para comprender las interacciones entre las plantillas de ARN y los aminoglucósidos. Se ha sugerido que los aminoglucósidos se unen a más de un sitio objetivo en la ribozima (6, 30). Recientemente, varios antibióticos aminoglucósidos, como la neomicina B, la tobramicina y la kanamicina A, se han dimerizado simétrica o asimétricamente mediante el uso de un «amarre», y sus afinidades de unión se compararon con las de los aminoglucósidos parentales monoméricos (30). Se sugirió que si había múltiples sitios de unión en el ARN, los aminoglucósidos dimerizados deberían unirse con mayor afinidad que el antibiótico original, siempre que hubiera múltiples sitios de unión accesibles. De hecho, se observó que los aminoglucósidos dimerizados se unen a la ribozima de Tetrahymena entre 20 y 1.200 veces más que los aminoglucósidos originales. Una explicación de la mayor afinidad de unión podría ser el mayor número de grupos amino cargados positivamente en el aminoglucósido dimerizado, pero este efecto parece ser sinérgico con la ventaja entrópica obtenida por la dimerización (30). También indicó la presencia de múltiples sitios de unión de alta afinidad para los antibióticos aminoglucósidos en una molécula de ARN. Otro estudio intentó explotar las propiedades de unión al ARN de la paromomicina y los comportamientos de intercalación de ciertos compuestos como el pireno y el tiazol naranja (48). Esta estrategia contemplaba los aminoglucósidos como medio para la entrega de agentes intercalantes al ARN. El conjugado de paromomicina con naranja de tiazol o pireno mostró mejores propiedades de unión a la plantilla de ARN del sitio A de 27 nucleótidos. De hecho, la constante de disociación para el conjugado de paromomicina con naranja de tiazol se midió en 46 nM, lo que se reportó como la mayor afinidad que el ARN A-site ha mostrado para cualquier ligando.

Los requisitos estructurales para la unión del ARN por los aminoglucósidos indicaron que una protuberancia en la secuencia del ARN es necesaria para permitir la unión de los aminoglucósidos (7). Utilizando un derivado específico del aptámero de ARN, se realizó una serie de estudios de interferencia química, modificación química y mutación para comprender los requisitos estructurales para la unión de la tobramicina al aptámero de ARN. Este aminoglucósido parece interactuar principalmente con las bases nucleicas del aptámero de ARN, pero no con la columna vertebral de fosfato. Sin embargo, se propuso que la presencia de una protuberancia era importante para la unión de alta afinidad de la tobramicina en una proporción estequiométrica, y se concluyó que una protuberancia crea una cavidad para las interacciones del aminoglucósido y la base nucleica (7). Esta analogía puede aplicarse a otros sitios del ARN, como la región de la cabeza de martillo y el sitio A, donde hay una cavidad debido al emparejamiento no canónico de las bases o a los bucles o protuberancias que crean un sitio adecuado para que los aminoglucósidos interactúen con los grupos fosfato aniónicos y las bases nucleicas. En este sentido, Westhoff y sus colegas (49) propusieron que la interacción de los aminoglucósidos con el ARN probablemente sea específica de la forma y no de la secuencia.

En consonancia con este concepto, se consideró que los campos electrostáticos en los pliegues del ARN son la fuerza que guía la unión (véase más adelante). Hermann y Westhoff (20) pudieron identificar las confirmaciones de acoplamiento de varios antibióticos aminoglucósidos en varias plantillas de ARN, como los aptámeros de tobramicina-ARN y la región del sitio A en el ARN 16S, para los que se disponía de información estructural. Sobre la base de esas observaciones, se predijo el modo de unión de los aminoglucósidos a la región del elemento de respuesta trans-activador en el VIH (20). En otro estudio sobre el RRE del VIH, la región de unión de la proteína Rev, Cho y Rando (8) investigaron el papel de una protuberancia de una sola base y una cavidad para la unión de los aminoglucósidos. En consonancia con hipótesis anteriores, se dedujo que los surcos en las regiones no dúplex del ARN son importantes para la unión de alta afinidad de los aminoglucósidos al ARN. En este caso, la protuberancia de una sola base no afectó a la unión, pero la cavidad, una región rica en G que consiste en dos pares de bases no canónicas y una sola U protuberante, tiene una alta afinidad por los aminoglucósidos. La alteración de la cavidad disminuyó la afinidad del ARN RRE por los aminoglucósidos, lo que indica que las protuberancias que contienen pares de bases no canónicas son los principales sitios de unión a los aminoglucósidos en esta plantilla de ARN (8).