Material vegetal

Las hojas de Strychnos spinosa Lam. se recogieron en enero de 2013 en el pueblo de Sakara, Zaria, Nigeria. El material vegetal fue identificado por Musa Muhammad, botánico de la sección de herbario del Departamento de Ciencias Biológicas (Universidad Ahmadu Bello, Zaria), donde se depositó un espécimen de muestra (nº 900161). Las hojas recolectadas se secaron en una habitación ventilada y libre de contaminación y luego se molieron hasta convertirlas en polvo utilizando un molino Macsalab (Modelo 2000 LAB Eriez), se guardaron en un recipiente de vidrio y se almacenaron en la oscuridad a temperatura ambiente (25 ± 3°C) antes de su uso.

Extracción y fraccionamiento líquido-líquido

Extracciones con acetona, metanol y diclorometano/metanol

Se utilizó una variación del método de Suffness & Douros para fraccionar los componentes presentes en diferentes extractos de hojas. El polvo de hoja seco (2 kg) se maceró tres veces en acetona (6 l) para obtener el extracto de acetona (AcetE, 75 g) después de filtrar y eliminar el disolvente al vacío. Los residuos se volvieron a macerar en metanol (6 l) siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente para la extracción con acetona para obtener el extracto de metanol (MetE, 119,2 g). Una parte de las hojas secas en polvo (1 kg) también se extrajo en una mezcla (1/1, v/v) de diclorometano/metanol (3 l) tres veces para obtener el extracto de diclorometano/metanol (DcmMetE, 114 g) después de filtrar y eliminar el disolvente al vacío. Una parte del extracto de acetona (70 g) se disolvió y fraccionó en una mezcla (1/1, v/v) de cloroformo y agua para obtener las fracciones de agua y cloroformo. Se añadió n-butanol a la fracción de agua para obtener las fracciones de n-butanol (nButF, 25,1 g) y agua (Wat1, 5 g). La fracción de cloroformo se concentró hasta sequedad y se disolvió en un 10% de agua en metanol antes de la extracción con hexano. Así, tras la adición de n-hexano se obtuvo la fracción de hexano (HexF, 23. 9 g) y el residuo de agua en metanol al 10%. La proporción de agua en metanol se incrementó para obtener un componente de 35% de agua en metanol que finalmente dio fracciones de cloroformo (ChlF, 7,05 g) y 35% de agua (wat2, 2,8 g) tras la adición de cloroformo. Del TLC comparativo, las fracciones de agua (Wat1) y 35% de agua en metanol (Wat2) se combinaron en una sola fracción (WatF, 7,8 g).

Extracción de alcaloides

Las hojas de S. spinosa (1 kg) se maceraron con la mezcla (96:3:1, v/v) de EtOAc-EtOH-NH4OH (600 ml) y luego se percolaron con EtOAc para dar el extracto (26 g) después de la eliminación del disolvente mediante evaporador rotatorio a presión reducida. El extracto se disolvió en EtOAc y se extrajo con ácido acético al 4% para obtener la fracción EtOAc (EtAcF, 20,02 g). La solución ácida (pH 3-4) se basificó a pH (8-9) con Na2CO3 y se extrajo tres veces con DCM para dar un extracto crudo de alcaloides (AlkE, 2,8 g) tras eliminar el disolvente al vacío.

Ensayo antimicrobiano

Microorganismos y preparación del inóculo

Los microorganismos utilizados fueron tres bacterias Gram-positivas, Bacillius cereus (ATCC 14579), Staphylococcus aureus (ATCC 29213) y Enterococcus faecalis (ATCC 29212), una bacteria Gram-negativa, Escherichia coli (ATCC 25922) y cuatro hongos, entre ellos tres levaduras Candida albicans, Cryptococcus neoformans (aislados en animales) y Candida albicans (ATCC 10231) y un hongo filamentoso Aspergillus fumigatus. Algunas cepas fúngicas utilizadas se cultivaron a partir de casos clínicos de enfermedades infecciosas fúngicas en animales, antes de su tratamiento, en el Departamento de Enfermedades Tropicales Veterinarias de la Facultad de Veterinaria. C. albicans se aisló de un pinzón de Gould, C. neoformans de un guepardo, mientras que A. fumigatus se aisló de un pollo que padecía una micosis sistémica.

Los cultivos bacterianos y fúngicos se tomaron de placas de cultivo de agar frescas de 24 h y se inocularon en caldo de dextrosa Sabouraud (SDB) fresco para los hongos y en caldo Mueller-Hinton (MHB) (Fluka, Suiza) para las bacterias, antes de realizar el ensayo. La turbidez de la suspensión microbiana se ajustó a un estándar McFarland de 0,5 equivalente a concentraciones de 1-5 × 108 y 1-5 × 107 ufc/ml para bacterias y hongos, respectivamente. Las suspensiones microbianas se diluyeron de nuevo (1:100) en medios para obtener un inóculo final de aproximadamente 1,5 × 106 ufc/ml para las bacterias y 1,5 × 105 ufc/ml para los hongos.

Determinación de la concentración inhibitoria mínima

Se utilizó un método de microdilución en serie de dos veces con violeta de tetrazolio como indicador del crecimiento microbiano para determinar los valores de la concentración inhibitoria mínima (CIM) de los extractos y las fracciones contra las bacterias y los hongos, según la modificación de Masoko et al. .

Se diluyeron en serie 100 μl (10 mg/ml) de extractos y fracciones disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO) por duplicado con agua destilada estéril en placas de microtitulación de 96 pocillos y se añadieron 100 μl de cultivo microbiano recién preparado en MHB o SDB a cada pocillo. Se utilizó DMSO (5%) como control negativo, mientras que la gentamicina y la anfotericina B (1 mg/ml) fueron controles positivos. Las placas de microtitulación se sellaron en bolsas de plástico y se incubaron durante 24 horas a 37°C. A continuación, se añadieron 40 μl de 0,2 mg/ml de violeta de p-iodonitrotetrazolio (INT) a cada pocillo y las placas de microtitulación se siguieron incubando a 37°C. Se determinaron las concentraciones inhibitorias mínimas después de 1 y 2 h para las bacterias, y de 16 y 36 h para los hongos. La CIM se determinó como la concentración más baja que inhibe el crecimiento microbiano, indicada por una disminución de la intensidad del color rojo del formazán.

Ensayos antioxidantes

Las actividades antioxidantes de los extractos y fracciones de las hojas de S. spinosa se determinaron en términos de capacidad de eliminación de radicales libres utilizando el 2,2′-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) y la sal de diamonio del ácido 2,2-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS).

Ensayo del DPPH

La actividad antioxidante se realizó según lo descrito por Du Toit et al. con ligeras modificaciones. Las muestras se disolvieron en metanol de grado HPLC (Sigma-Aldrich, Alemania) y se diluyeron dos veces en serie hasta alcanzar rangos de concentración de 1000 a 7,81 μg/ml para los extractos y fracciones, y de 40 a 0,31 μg/ml para un estándar de referencia de ácido L-ascórbico (Sigma, Alemania). Brevemente, se introdujeron 40 μl de (10 mg/ml) de muestras en una placa de microtitulación de 96 pocillos (Bioster, España) y se diluyeron dos veces en serie en metanol. A continuación, se introdujeron 160 μl de (3,7 mg/100 ml) de solución metanólica de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) en cada pocillo y, tras 30 minutos de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad, se midió la absorbancia a 517 nm utilizando un lector de microplacas multimodo (BioTek, Estados Unidos). La actividad de barrido de radicales libres de cada muestra y del estándar de referencia se determinó como porcentaje de inhibición obtenido a partir de la siguiente fórmula:

Con Absample como la absorbancia del extracto con DPPH, Abblank como la absorbancia del extracto sin DPPH y Abcontrol como la absorbancia del metanol y DPPH. La concentración de las muestras que reducen el 50% de los radicales libres DPPH (IC50) se determinó trazando el porcentaje de inhibición frente a las concentraciones de las muestras. El ensayo se repitió tres veces y los resultados se expresan como media ± desviación estándar.

Ensayo ABTS

La capacidad de eliminación del radical ABTS de los extractos y fracciones se determinó utilizando un método de Re et al. con ligeras modificaciones. Brevemente, el radical ABTS se generó haciendo reaccionar una solución 7 mM de ABTS y una solución 2,45 mM de persulfato de potasio a temperatura ambiente durante 12 h. La absorbancia de la solución madre de radical ABTS se ajustó a 7,00 ± 0,02 a 734 nm antes de utilizarla. Se introdujeron 40 μl de una solución de extractos o fracciones disueltas en metanol de grado HPLC (Sigma-Aldrich, Alemania) en placas de microtitulación y se diluyeron en serie hasta alcanzar concentraciones comprendidas entre 15,62 y 2000 μg/ml. Se prepararon Trolox (Sigma, Alemania) y ácido L-ascórbico (Sigma, Alemania) en concentraciones que iban de 200 a 1,56 μg/ml. A continuación, se añadieron 160 μl de solución de ABTS a los pocillos (excepto el blanco) y se midió la absorbancia a 734 nm tras 6 minutos de incubación a temperatura ambiente. Se utilizaron Trolox y ácido ascórbico como controles positivos, metanol como control negativo y extractos o fracciones sin ABTS como blanco. El porcentaje de inhibición de ABTS-+ y el IC50 se calcularon como se informó anteriormente para el ensayo de DPPH.

Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad de los extractos de acetona y las fracciones contra las células de riñón de mono Vero se evaluó mediante el ensayo de reducción de MTT como se describió anteriormente con ligeras modificaciones. Las células se sembraron a una densidad de 1 × 105 células/ml (100 μl) en placas de microtitulación de 96 pocillos y se incubaron a 37°C y 5% de CO2 en un ambiente humidificado. Tras 24 h de incubación, se añadieron muestras (100 μl) a distintas concentraciones finales a los pocillos que contenían células. La doxorrubicina se utilizó como referencia positiva. También se incluyó un control en blanco adecuado con concentraciones equivalentes de acetona y las placas se siguieron incubando durante 48 h en un incubador de CO2. A continuación, se aspiró el medio de cada pocillo de las células, que se lavaron con PBS, y finalmente se añadió medio fresco (200 μl) a cada pocillo. A continuación, se añadieron 30 μl de MTT (5 mg/ml en PBS) a cada pocillo y las placas se incubaron a 37 °C durante 4 h. Se aspiró el medio de los pocillos y se añadió DMSO para solubilizar los cristales de formazán formados. La absorbancia se midió en un lector de microplacas BioTek Synergy a 570 nm. La inhibición del crecimiento celular de cada extracto se expresó en términos de valores LC50, definidos como la concentración que causó el 50% de inhibición de la viabilidad celular. Los valores del índice de selectividad (IS) se calcularon dividiendo los valores de citotoxicidad LC50 por los valores MIC (IS = LC50/MIC). Los ensayos se realizaron por cuadruplicado y cada experimento se repitió tres veces.

Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los valores se expresaron como media ± desviación estándar. Las diferencias entre los valores se evaluaron para la significación utilizando el análisis de la varianza y los resultados se compararon utilizando la diferencia mínima significativa de Fisher (LSD) a un nivel de significación del 5%.