PCR del gen mecA

Se amplificaron un fragmento de 188 pb dentro del gen mecA y otro de 178 pb dentro del gen Sa442 específico de S. aureus específico Sa442 se amplificaron para los aislados 1 y 2 en reacciones separadas en un LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) utilizando verde SYBR con los cebadores Mec-S y Mec-A o Sa442-F y Sa442-RS, respectivamente, como se ha descrito anteriormente (5). Los aislados mecA-positivos generan temperaturas de fusión del verde SYBR de 79°C. Los aislados positivos para Sa442 también generan una temperatura de fusión del verde SYBR de 79°C. S. aureus ATCC 29213 (sensible a la oxacilina) y S. aureus ATCC 43300 (resistente a la oxacilina) se utilizaron como controles para el gen Sa442 y como controles negativos y positivos, respectivamente, para el gen mecA. A diferencia de los controles, no se generó ningún producto mecA o Sa442 para los aislados 1 y 2. Se realizó una PCR adicional para detectar un fragmento mayor de 533 pb del gen mecA (4). No se generó ningún producto en los aislados 1 y 2 ni en S. aureus ATCC 29213, pero sí se generó un producto del tamaño esperado en S. aureus ATCC 43300. El gen 16S rRNA, utilizado como control positivo, se amplificó en todas las cepas (datos no mostrados).

La detección precisa y oportuna de la resistencia a la meticilina en S. aureus es una función importante del laboratorio de microbiología clínica (20). Aunque la detección del gen mecA mediante PCR es el patrón de oro, la prueba de aglutinación de látex PBP2a ha demostrado ser una prueba sencilla y rápida, con buenas características de rendimiento para detectar la resistencia a la meticilina tanto en S. aureus como en especies estafilocócicas coagulasa-negativas, a pesar de la necesidad de inducción previa en algunos casos (1, 21). El ensayo PBP2a utiliza partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos monoclonales elevados contra PBP2a (11). La especificidad de esta prueba se aproxima al 100% (18, 19). Aunque no hay informes sobre el rendimiento de las pruebas de aglutinación de látex de PBP2a para los aislados de S. intermedius, se han observado resultados falsos positivos de PBP2a con dos aislados de S. warneri, uno a 1 min y otro a 6 min, que eran ambos negativos a la PCR de mecA con una CIM de oxacilina de ≤0,5 μg/ml (21). Según el prospecto del fabricante, las reacciones falsas positivas suelen ser aglutinaciones débiles que suelen ser negativas al repetir la prueba con un cultivo fresco. Sin embargo, encontramos que nuestros dos aislados fueron repetidamente positivos después de múltiples subcultivos, siendo uno de ellos fuertemente positivo. La cepa de S. intermedius ATCC 29663 era, de hecho, negativa por la prueba PBP2a, pero también era fenotípicamente diferente de las dos cepas clínicas con respecto a la fermentación positiva del manitol, la negatividad de la β-lactamasa y la sensibilidad a la penicilina (resultados no mostrados).

La positividad a la coagulasa se utiliza habitualmente para atribuir importancia clínica y patogenicidad a los aislados de Staphylococcus spp. Aunque S. aureus es el estafilococo positivo a la coagulasa más comúnmente aislado en el laboratorio clínico, S. intermedius, S. delphini, S. schleiferi subsp. coagulans, S. lutrae y algunas cepas de S. hyicus también son positivos a la coagulasa (1). Los laboratorios suelen utilizar una combinación de pruebas para detectar la coagulasa libre o el factor de aglutinación con y sin proteína A para identificar los estafilococos coagulasa-positivos. Los aislados de S. intermedius son positivos para la coagulasa libre pero son negativos para la proteína A, y el 14% de los aislados tienen un factor de aglutinación, lo que explicaría el resultado positivo de la coagulasa en portaobjetos y el débilmente positivo del látex del estafilococo BACTi para el aislado 1 (6). Como se ha descrito anteriormente, encontramos que la positividad de la pirrolidonil arilamidasa es una forma rápida de determinar que un estafilococo positivo a la coagulasa no es S. aureus (10). Creemos que nuestros casos sugieren que la verdadera incidencia de S. intermedius en las infecciones de heridas humanas está probablemente subestimada, porque todos los estafilococos positivos a la coagulasa suelen agruparse como S. aureus (17). A falta de una identificación definitiva de S. intermedius por métodos fenotípicos o bioquímicos, la secuenciación del gen 16S rRNA ha resultado útil para la clasificación taxonómica de las especies de Staphylococcus y Macrococcus (8).

Un estudio inicial realizado en 1989 mostró que el 72% de los aislados de S. intermedius procedentes de gingiva canina e infecciones de heridas caninas eran sensibles a la penicilina, y ninguno era resistente a la oxacilina (16). Un estudio más reciente reveló que la resistencia a la oxacilina es un problema cada vez mayor en los aislados de S. intermedius, y se observaron tasas de resistencia a la oxacilina entre un 60 y un 85% mayores en los aislados de la nariz, los ojos y los abscesos de los perros, en comparación con los de las demás localizaciones (7). En la primera infección humana debida a S. intermedius resistente a la meticilina, en la que fue el agente causante de la neumonía, la CIM de la oxacilina fue de 32 μg/ml (3). Nuestros dos aislados eran resistentes a la penicilina y eran β-lactamasas positivas; la CIM de la oxacilina para estos aislados fue de 0,125 μg/ml. La resistencia a la penicilina en estos aislados, en ausencia de resistencia a la oxacilina con una PCR mecA negativa y de susceptibilidad a combinaciones de β-lactámicos/β-lactamasas, puede explicarse por el resultado positivo del ensayo de β-lactamasas. Utilizando el conjunto de cebadores dirigidos a un fragmento de 533 pb del gen mecA, Gortel et al. confirmaron que el gen mecA confiere resistencia a la meticilina en estafilococos aislados de perros (4). Estos investigadores descubrieron que entre 10 cepas estafilocócicas coagulasa-positivas portadoras de mecA, 9 eran S. aureus y 1 era S. intermedius. Plantearon la hipótesis de que la diferencia en la prevalencia de la resistencia a la meticilina en S. intermedius en comparación con la de S. aureus se debía a una diferencia en la regulación de mecA entre las especies o a la falta de una presión de selección antibiótica intensa en S. intermedius (4). Aunque no existen criterios interpretativos específicos del NCCLS para los estafilococos coagulasa-positivos distintos de S. aureus, los resultados de las pruebas de susceptibilidad a la oxacilina por métodos fenotípicos y genotípicos (PCR del gen mecA utilizando dos conjuntos de cebadores dirigidos a fragmentos de 188 y 533 pb), combinados con las bajas CIM de oxacilina comparadas con las notificadas anteriormente para los aislados de S. intermedius (CIM > 4 μg/ml), establece que los aislados 1 y 2 de este estudio son sensibles a la oxacilina (3, 4).

Está bien aceptado que la resistencia a la meticilina en S. aureus se debe principalmente a la adquisición de una proteína adicional de unión a la penicilina, PBP2a, codificada por el gen mecA. La búsqueda del origen del gen mecA condujo a la identificación de un posible precursor evolutivo en S. sciuri, un comensal de los animales. El homólogo del mecA en S. sciuri mostró un 79,5% de similitud en la secuencia de ADN con el gen mecA de S. aureus y un 88% de identidad en aminoácidos con PBP2a. El homólogo mecA de S. sciuri no confiere resistencia a la meticilina en la naturaleza. Sin embargo, Couto et al. identificaron aislados de S. sciuri resistentes a la meticilina procedentes de humanos, en los que la sobreexpresión del homólogo mecA resultante de la inserción de un elemento IS256 aguas arriba del gen estructural o de alteraciones de un solo nucleótido en la región promotora dio lugar a la producción de una proteína funcionalmente parecida a la PBP2a (2). Al igual que los aislados de S. sciuri, los aislados de S. intermedius descritos aquí pueden contener un homólogo de mecA que codifica una proteína parecida a la PBP2a, que presenta reacción cruzada con la prueba de aglutinación de látex de PBP2a, pero no confiere resistencia a la meticilina. También es posible el mimetismo antigénico con una proteína completamente no relacionada. En cualquier caso, esperamos concienciar a la comunidad microbiológica de que existen aislados clínicos que pueden cuestionar la especificidad de la prueba de aglutinación de látex de PBP2a.

En conclusión, proporcionamos el primer informe de resultados falsos positivos de PBP2a para dos cepas de S. intermedius que, combinados con un error inicial en la interpretación de las pruebas fenotípicas, condujeron a una identificación errónea como SARM. Los resultados falsos positivos de PBP2a podrían conducir a intentos de control de la infección mal dirigidos, al uso innecesario de antibióticos como la vancomicina y a un aumento general de los gastos hospitalarios (20). Estos casos subrayan la importancia de perseguir activamente los resultados discrepantes de las pruebas de laboratorio para evitar errores de notificación. La identificación precisa de las especies de estafilococos coagulasa-positivos es esencial para determinar la patogenicidad, la importancia clínica, los patrones de susceptibilidad y la epidemiología de los aislados clínicos.