Pflanzenmaterial

Die Blätter von Strychnos spinosa Lam. wurden im Januar 2013 im Dorf Sakara, Zaria, Nigeria, gesammelt. Das Pflanzenmaterial wurde von Musa Muhammad, einem Botaniker aus dem Herbarium der Abteilung für biologische Wissenschaften (Ahmadu Bello University, Zaria) identifiziert, wo ein Belegexemplar (Nr. 900161) hinterlegt war. Die gesammelten Blätter wurden in einem belüfteten Raum frei von Verunreinigungen getrocknet und dann mit einer Macsalab-Mühle (Modell 2000 LAB Eriez) zu einem Pulver gemahlen, in einem Glasbehälter aufbewahrt und vor der Verwendung im Dunkeln bei Raumtemperatur (25 ± 3°C) gelagert.

Extraktion und Flüssig-Flüssig-Fraktionierung

Aceton-, Methanol- und Dichlormethan/Methanol-Extraktionen

Eine Variation der Methode von Suffness & Douros wurde verwendet, um die in den verschiedenen Blattextrakten vorhandenen Komponenten zu fraktionieren. Das getrocknete Blattpulver (2 kg) wurde dreimal in Aceton (6 l) mazeriert, um den Aceton-Extrakt (AcetE, 75 g) nach Filtration und Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum zu erhalten. Die Rückstände wurden nach dem gleichen Verfahren wie bei der Acetonextraktion in Methanol (6 l) weiter mazeriert, um den Methanolextrakt (MetE, 119,2 g) zu erhalten. Ein Teil der getrockneten, pulverisierten Blätter (1 kg) wurde ebenfalls dreimal in einem Gemisch (1/1, v/v) aus Dichlormethan/Methanol (3 l) extrahiert, um den Dichlormethan/Methanolextrakt (DcmMetE, 114 g) zu erhalten, nachdem er filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde. Ein Teil des Aceton-Extrakts (70 g) wurde in einem Gemisch (1/1, v/v) aus Chloroform und Wasser gelöst und fraktioniert, um die Wasser- und Chloroformfraktionen zu erhalten. Der Wasserfraktion wurde n-Butanol zugesetzt, um die n-Butanol- (nButF, 25,1 g) und Wasserfraktionen (Wat1, 5 g) zu erhalten. Die Chloroformfraktion wurde zur Trockne konzentriert und vor der Extraktion mit Hexan in 10 % Wasser in Methanol gelöst. So erhielt man die Hexanfraktion (HexF, 23,9 g) und den Rückstand von 10 % Wasser in Methanol nach Zugabe von n-Hexan. Der Anteil von Wasser in Methanol wurde erhöht, um eine 35%ige Wasser-in-Methanol-Komponente zu erhalten, die schließlich nach Zugabe von Chloroform die Fraktionen Chloroform (ChlF, 7,05 g) und 35% Wasser (wat2, 2,8 g) ergab. Bei der vergleichenden TLC wurden die Fraktionen Wasser (Wat1) und 35 % Wasser in Methanol (Wat2) zu einer Fraktion (WatF, 7,8 g) zusammengefasst.

Alkaloidextraktion

Die Blätter von S. spinosa (1 kg) wurden mit dem Gemisch (96:3:1, v/v) aus EtOAc-EtOH-NH4OH (600 ml) mazeriert und dann mit EtOAc durchgespült, um den Extrakt (26 g) nach Entfernung des Lösungsmittels mit einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck zu erhalten. Der Extrakt wurde in EtOAc gelöst und mit 4 % Essigsäure extrahiert, um die EtOAc-Fraktion (EtAcF, 20,02 g) zu erhalten. Die saure Lösung (pH 3-4) wurde mit Na2CO3 auf pH (8-9) basisch gemacht und dreimal mit DCM extrahiert, um nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum einen rohen Alkaloidextrakt (AlkE, 2,8 g) zu erhalten.

Antimikrobieller Test

Mikroorganismen und Inokulumherstellung

Die verwendeten Mikroorganismen waren drei grampositive Bakterien, Bacillius cereus (ATCC 14579), Staphylococcus aureus (ATCC 29213) und Enterococcus faecalis (ATCC 29212), ein gramnegatives Bakterium, Escherichia coli (ATCC 25922); und vier Pilze, darunter drei Hefepilze Candida albicans, Cryptococcus neoformans (Tierisolate) und Candida albicans (ATCC 10231) sowie ein Fadenpilz Aspergillus fumigatus. Einige der verwendeten Pilzstämme wurden aus klinischen Fällen von infektiösen Pilzerkrankungen bei Tieren vor der Behandlung in der Abteilung für tropische Tierkrankheiten der Veterinärmedizinischen Fakultät gezüchtet. C. albicans wurde von einem Gouldfinken isoliert, C. neoformans von einem Geparden, während A. fumigatus von einem Huhn isoliert wurde, das an einer systemischen Mykose litt.

Bakterien- und Pilzkulturen wurden von 24 h frischen Agar-Kulturplatten entnommen und vor der Durchführung des Tests in frische Sabouraud-Dextrose-Bouillon (SDB) für Pilze und Mueller-Hinton-Bouillon (MHB) (Fluka, Schweiz) für Bakterien beimpft. Die Trübung der mikrobiellen Suspension wurde auf einen McFarland-Standard von 0,5 eingestellt, was Konzentrationen von 1-5 × 108 bzw. 1-5 × 107 cfu/ml für Bakterien bzw. Pilze entspricht. Die mikrobiellen Suspensionen wurden weiter (1:100) in Medien verdünnt, um ein endgültiges Inokulum von etwa 1,5 × 106 KBE/ml für Bakterien und 1,5 × 105 KBE/ml für Pilze zu erhalten.

Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration

Eine zweifache serielle Mikroverdünnungsmethode mit Tetrazoliumviolett als Indikator für mikrobielles Wachstum wurde verwendet, um die minimale Hemmkonzentration (MHK) für Extrakte und Fraktionen gegen Bakterien und Pilze zu bestimmen, modifiziert von Masoko et al.

Jeweils 100 μl (10 mg/ml) der in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelösten Extrakte und Fraktionen wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten seriell zweifach mit sterilem destilliertem Wasser verdünnt und 100 μl einer frisch zubereiteten mikrobiellen Kultur in MHB oder SDB wurden in jede Vertiefung gegeben. DMSO (5%) wurde als Negativkontrolle verwendet, während (1 mg/ml) Gentamicin und Amphotericin B als Positivkontrollen dienten. Die Mikrotiterplatten wurden in Plastikbeuteln versiegelt und 24 Stunden lang bei 37 °C bebrütet. Danach wurden 40 μl von 0,2 mg/ml p-Iodonitrotetrazoliumviolett (INT) in jede Vertiefung gegeben und die Mikrotiterplatten bei 37 °C weiter inkubiert. Die minimalen Hemmkonzentrationen wurden für Bakterien nach 1 und 2 Stunden und für Pilze nach 16 und 36 Stunden bestimmt. Die MHK wurde als die niedrigste Konzentration bestimmt, die das mikrobielle Wachstum hemmt, was durch eine Abnahme der Intensität der roten Farbe des Formazans angezeigt wird.

Antioxidative Assays

Die antioxidativen Aktivitäten der Extrakte und Fraktionen aus den Blättern von S. spinosa wurden als Radikalfänger unter Verwendung von 2,2′-Diphenyl-1-picryhydrazyl (DPPH) und 2,2-Azino-bis-(3-Ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)-Diammoniumsalz (ABTS) bestimmt.

DPPH-Assay

Die antioxidative Aktivität wurde wie von Du Toit et al. beschrieben mit leichten Änderungen durchgeführt. Die Proben wurden in HPLC-Methanol (Sigma-Aldrich, Deutschland) gelöst und zweifach seriell verdünnt auf Konzentrationsbereiche von 1000 bis 7,81 μg/ml für Extrakte und Fraktionen und 40 bis 0,31 μg/ml für eine Standardreferenz L-Ascorbinsäure (Sigma, Deutschland). Kurz gesagt wurden 40 μl (10 mg/ml) der Proben in eine 96-Well-Mikrotiterplatte (Bioster, Spanien) gegeben und zweimal seriell in Methanol verdünnt. Anschließend wurden 160 μl (3,7 mg/100 ml) einer methanolischen Lösung von 2,2-Diphenyl-1-picryhydrazyl (DPPH) in jede Vertiefung gegeben und nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln wurde die Absorption bei 517 nm mit einem Multi-Mode Microplate Reader (BioTek, USA) gemessen. Die Radikalfängeraktivität jeder Probe und des Referenzstandards wurde als Prozentsatz der Hemmung nach folgender Formel bestimmt:

Mit Absample als Extinktion des Extrakts mit DPPH, Abblank als Extinktion des Extrakts ohne DPPH und Abcontrol als Extinktion von Methanol und DPPH. Die Konzentration der Proben, die 50 % der freien DPPH-Radikale reduziert (IC50), wurde durch Auftragen des Prozentsatzes der Hemmung gegen die Probenkonzentrationen bestimmt. Der Test wurde dreimal wiederholt, und die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben.

ABTS-Test

Das ABTS-Radikalfängervermögen der Extrakte und Fraktionen wurde nach einer Methode von Re et al. mit leichten Modifikationen bestimmt. Kurz gesagt, das ABTS-Radikal wurde durch Reaktion von 7 mM ABTS-Lösung und 2,45 mM Kaliumpersulfat-Lösung bei Raumtemperatur für 12 h erzeugt. Die Absorption der ABTS-Radikal-Stammlösung wurde vor der Verwendung auf 7,00 ± 0,02 bei 734 nm eingestellt. 40 μl einer Lösung von Extrakten oder Fraktionen, die in HPLC-Methanol (Sigma-Aldrich, Deutschland) gelöst waren, wurden in Mikrotiterplatten gegeben und zwei Mal seriell auf Konzentrationen zwischen 15,62 und 2000 μg/ml verdünnt. Trolox (Sigma, Deutschland) und L-Ascorbinsäure (Sigma, Deutschland) wurden in Konzentrationen von 200 bis 1,56 μg/ml hergestellt. Anschließend wurden 160 μl der ABTS-Lösung in die Vertiefungen (außer dem Leerwert) gegeben und die Absorption bei 734 nm nach 6 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur gemessen. Trolox und Ascorbinsäure wurden als Positivkontrollen, Methanol als Negativkontrolle und Extrakte oder Fraktionen ohne ABTS als Leerwert verwendet. Der Prozentsatz der ABTS-+ -Hemmung und die IC50 wurden wie oben für den DPPH-Assay berechnet.

Zytotoxizitätstest

Die Zytotoxizität der Acetonextrakte und Fraktionen gegen Vero-Affennierenzellen wurde durch den MTT-Reduktionstest wie zuvor beschrieben mit leichten Änderungen bewertet. Die Zellen wurden in einer Dichte von 1 × 105 Zellen/ml (100 μl) in 96-Well-Mikrotiterplatten ausgesät und bei 37 °C und 5 % CO2 in einer befeuchteten Umgebung inkubiert. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die Proben (100 μl) in unterschiedlichen Endkonzentrationen zu den Vertiefungen mit den Zellen gegeben. Doxorubicin wurde als positive Referenz verwendet. Eine geeignete Blindkontrolle mit äquivalenten Aceton-Konzentrationen wurde ebenfalls zugegeben, und die Platten wurden 48 Stunden lang in einem CO2-Inkubator weiter bebrütet. Danach wurde das Medium in jeder Vertiefung von den Zellen abgesaugt, die dann mit PBS gewaschen wurden, und schließlich wurde frisches Medium (200 μl) in jede Vertiefung gegeben. Dann wurden 30 μl MTT (5 mg/ml in PBS) in jede Vertiefung gegeben und die Platten 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Das Medium wurde aus den Vertiefungen abgesaugt und DMSO hinzugefügt, um die gebildeten Formazankristalle zu lösen. Die Absorption wurde mit einem BioTek Synergy Mikroplatten-Lesegerät bei 570 nm gemessen. Die Hemmung des Zellwachstums für jeden Extrakt wurde in Form von LC50-Werten ausgedrückt, definiert als die Konzentration, die eine 50%ige Hemmung der Lebensfähigkeit der Zellen bewirkt. Der Selektivitätsindex (SI) wurde berechnet, indem die zytotoxischen LC50-Werte durch die MIC-Werte geteilt wurden (SI = LC50/MIC). Die Tests wurden in vierfacher Ausführung durchgeführt und jedes Experiment wurde dreimal wiederholt.

Statistische Analyse

Alle Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und die Werte als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die Unterschiede zwischen den Werten wurden mit Hilfe der Varianzanalyse auf ihre Signifikanz geprüft und die Ergebnisse mit Hilfe der Fisher’s least significant difference (LSD) auf einem Signifikanzniveau von 5 % verglichen.