Mathematische Charakterisierung der Dynamik des TA

Die Dynamik des TA wird dadurch bestimmt, wie seine Komponenten räumlich und zeitlich auf dem Promotor organisiert sind. Da die TA viele verschiedene Konfigurationszustände annehmen kann und die Zustandsentwicklung im Wesentlichen stochastisch ist, wobei zahlreiche Moleküle und komplexe Wechselwirkungen beteiligt sind, verwenden wir die Theorien der Statistik und Wahrscheinlichkeit, um die Dynamik der TA zu untersuchen. Der Einfachheit halber nehmen wir an, dass die Konzentrationen der mit der Transkription verbundenen Spezies, wie z. B. GTFs, um das Modellgen herum konstant bleiben und dass sich die molekularen Wechselwirkungen mit dem Promotor in einem dynamischen Gleichgewicht befinden. Der Begriff „dynamisches Gleichgewicht“ bedeutet nicht, dass alle molekularen Wechselwirkungen umkehrbar sind; er setzt lediglich voraus, dass die TA nach einiger Zeit ihren aktuellen Zustand wieder einnimmt. Ein Modellgen und alle Arten, die es umgeben, bilden ein System. Die obigen Annahmen implizieren, dass sich ein solches System in einem stabilen Zustand befindet. Betrachten wir ein statistisches Ensemble, das aus einer großen Anzahl solcher im Wesentlichen identischer Systeme besteht, von denen sich jedes unabhängig entwickelt. Die Anzahl der Systeme ist so groß, dass alle möglichen Konfigurationszustände der TA durch dieses Ensemble abgedeckt werden können. Das heißt, jeder Zustand, den ein einzelnes Gen durchläuft, bildet die Zustände der anderen Gene im Ensemble ab, und der Anteil der Gene in einem bestimmten Zustand X (z. B. Gene, deren Enhancer durch Aktivatoren gebunden sind), P(X), bleibt über die Zeit konstant. Wenn ein einzelnes Gen zu einem beliebigen Zeitpunkt beobachtet wird, ist die Wahrscheinlichkeit, dass sich das Gen im Zustand X befindet, ebenfalls P(X). In diesem Sinne ist der Zustand, in dem sich ein einzelnes Gen befindet, ein zufälliges Ereignis.

Für das Minimalmodell (Abb. 1a) definieren wir alle Konfigurationszustände der TA als universelle Menge Ω und die verschiedenen Zustände mit den gleichen Schlüsseleigenschaften jeweils als die folgenden Teilmengen (Abb. 1b). A bedeutet, dass der Enhancer durch einen Aktivator gebunden ist. S bedeutet, dass der Kernpromotor durch die Proteine des SCF gebunden ist. M bedeutet, dass sich eine naszierende mRNA in der Reifung befindet (einschließlich des Prozesses von der PIC-Bildung bis zum Eintritt von Pol II in die Elongation). J bedeutet, dass der an den Enhancer gebundene Aktivator über den Mediator mit dem SCF, PIC oder OPC verbunden ist. Da die eukaryotische Transkriptionsinitiierung die Anwesenheit des SCF auf dem Kernpromotor erfordert4,12, M⊂S. Gemäß den Definitionen J⊂AS. In der Menge MJ sind M und A gleichzeitig vorhanden, d. h. die an den Enhancer gebundenen Aktivatoren können die Wirkung von Pol II über den Mediator direkt beeinflussen. Somit wird die Transkriptionsinitiierung unter direkter Regulierung durch Aktivatoren durch die Menge MJ beschrieben, während die basale, aktivatorunabhängige Transkriptionsinitiierung in der Menge M-J enthalten ist. Die Wahrscheinlichkeit einer naszierenden mRNA in der Trächtigkeit, d. h. die Wahrscheinlichkeit, dass eine mRNA gebildet wird, ist

wobei q eine Konstante ist, die die basale Transkriptionsinitiation darstellt, und Aj eine Teilmenge von A ist (siehe S1 in den ergänzenden Informationen für Details). In Aj sind die an den Enhancer gebundenen Aktivatoren obligatorisch für den Kontakt mit dem SCF-, PIC- oder OPC-gebundenen Mediator. Gleichung (1) charakterisiert die Beziehung zwischen der mRNA-Produktion und den dynamischen Eigenschaften des TA.

Kodiert die Konzentration der Transkriptionsaktivatoren

Aufgrund der unterschiedlichen Architekturen des Promotorchromatins in verschiedenen Transkriptionsstadien können die an den Enhancer gebundenen Aktivatoren verschiedene Funktionen ausüben, wie die Förderung der Histonacetylierung und die Rekrutierung von GTFs4,5,15. Die Gruppe Aj umfasst insbesondere die an den Enhancer gebundenen Aktivatoren, die für die Steuerung der basalen Transkriptionsmaschinerie und die Kontrolle der Transkriptionsinitiierung verantwortlich sind. Darüber hinaus sind die Aktivitäten dieser Aktivatoren auch mit der Kodierung der Kernkonzentration der Aktivatoren verbunden, denn ist der einzige Faktor in Gleichung (1), der von der Konzentration der Aktivatoren abhängt. Hier untersuchen wir die Dynamik solcher Aktivatoren.

Aktivatoren bewegen sich schnell im Zellkern, und die Wahrscheinlichkeit, dass sie den Enhancer erreichen, ist proportional zu ihrer Häufigkeit im Zellkern9. Betrachten wir einen Zeitraum, in dem die an der Menge Aj beteiligten Aktivatoren für m (m = 1, 2, 3, …) Zyklen an den Enhancer binden und sich dann von ihm entfernen. Wir definieren die zeitliche Belegungsrate RTOR dieser Aktivatoren als , wobei und die Bindungs- bzw. Entbindungszeit des j-ten Zyklus bezeichnen. Für die feste Anzahl na von Aktivatoren im Zellkern ergibt sich

, wobei aon und aoff die Neigungsfunktionen der Bindung bzw. Entbindung sind (siehe S2 in den ergänzenden Informationen). aon ist eine Funktion von na, während aoff unabhängig von na ist. Gleichung (2) zeigt, dass mit steigendem m zu einem deterministischen Wert konvergiert, der eine monoton steigende Funktion von na ist (Abb. 1c-d und Abb. S1; dies ist eine allgemeine Eigenschaft und kann auf Fälle angewendet werden, in denen die Anzahl der kognitiven Bindungsstellen auf dem Enhancer größer als eins ist (siehe Gleichungen S13-S18)). Diese Konvergenz impliziert, dass sogar die zeitlich variierende Konzentration von Aktivatoren durch RTOR kodiert werden kann, vorausgesetzt, dass die Aktivatoren häufig genug über ein Zeitfenster mit nahezu unveränderter Konzentration auf dem Enhancer ein- und ausgeschaltet werden. In der Tat gibt es aktive Disassoziationsmechanismen, die einen schnellen Wechsel der Aktivatoren gewährleisten9,19,20,21,22. Die Bindungszeit wurde auf einige Sekunden bis einige zehn Sekunden geschätzt9,10. Darüber hinaus wurde am endogenen CUP1-Gen nachgewiesen, dass dieser schnelle Wechsel funktionell ist10. Vermutlich kodiert der RTOR die Konzentration von Transkriptionsaktivatoren. Andererseits beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass der Enhancer während des Zeitraums, in dem die Aktivatoren den Enhancer m-mal an- und abschalten, von einem solchen Aktivator gebunden wird, . Da der Durchschnitt von über das Ensemble auch f(na) ist, haben wir

Die Randbedingungen, die eine zuverlässige Transkriptionsantwort gewährleisten

Angesichts der Stochastizität des Auftretens von Transkriptionsereignissen erfordert eine zuverlässige Transkriptionsantwort, dass der RTOR-Code, der die Konzentration der Aktivatoren zeitlich repräsentiert, mit hoher Zuverlässigkeit in die Menge der Transkripte umgesetzt wird. Im Idealfall, wenn P(S), und alle gleich 1 wären, würde die exakte Informationstransduktion erreicht werden. Im Folgenden stellen wir die Bedingungen dar, unter denen diese drei Faktoren groß genug sein können, um zuverlässige Transkriptionsantworten in Gegenwart zufälliger Fluktuationen zu gewährleisten (Abb. S2 und S3 liefern intuitive Erklärungen für diesen Unterabschnitt).

Gleichung (3) impliziert, dass die Konzentration der Aktivatoren nicht ausreichend kodiert werden kann, ohne dass die SCF auf dem Promotor verbleibt. Daher sollte sich der SCF schnell zusammensetzen, wenn die Chromatinarchitektur dies zulässt, und viel stabiler sein als die an den Enhancer gebundenen Aktivatoren (Bedingung I). Eine solche Stabilität des SCF wurde experimentell beobachtet, und die Bindungszeit von TBP (TATA-bindendes Protein, die Kernkomponente des SCF) am Promotor kann in menschlichen Zellen bis zu 20 Minuten betragen11. Für ist Aj eine Vorbedingung für das Auftreten von J. Da RTOR durch die einzelnen kurzen Bindungszeiten der Aktivatoren bestimmt wird, sollte J unmittelbar nach dem Auftreten von Aj erfolgen (Abb. S3). Andernfalls geht die Information über RTOR größtenteils verloren oder wird sogar fälschlicherweise zur Steuerung der Transkriptionsinitiierung verwendet (beachten Sie, dass J eine Vorbedingung für M ist). Um den RTOR-Code korrekt zu übertragen, sollte der Mediator daher darauf warten, die zyklischen Aktivatoren zu binden und die Information durch Allosterie23,24,25 zu übertragen (Bedingung II). Dies liegt daran, dass andere Arten von molekularen Wechselwirkungen wie freie Kollisionen die Information über den Bindungszeitpunkt von Aktivatoren nicht präzise übermitteln können. Ein solcher Allosterismus des Mediators wird durch frühere Arbeiten unterstützt26. bestimmt, wie die von J vererbte Information über RTOR umgesetzt wird, um die Menge der Transkripte zu steuern. Da RTOR von der intermittierenden Bindung von Aktivatoren abhängt, erfordert ein großer , dass während der kurzen Bindungsperioden Transkripte mit einer ziemlich schnellen Rate produziert werden (Abb. S2) (Bedingung III). Diese Eigenschaft wird auch durch rechnerische Abschätzungen der experimentellen Daten bestätigt (siehe S3 der ergänzenden Informationen). Daher können alle drei Bedingungen auf natürliche Weise erfüllt werden.

Der dynamische Mechanismus der aktivator-regulierten Transkription

Die drei oben genannten Bedingungen bestimmen zusammen, wie die TA funktioniert. Es entsteht wiederholt ein Zustand, in dem sich ein relativ stabiler klammerartiger Raum zwischen dem Mediator und dem Enhancer ausbildet (Abb. 2; entsprechend den Bedingungen I und II). Da sich der SCF experimentell als nicht sehr stabil erwiesen hat11 , wird dieser Raum vorübergehend aufgebaut. Der klammerartige Raum zieht freie Aktivatoren an und schält sie dann schnell ab, wobei RTOR durch die Konzentration der Aktivatoren bestimmt wird (gemäß den Gleichungen (2-3)). Sobald ein Aktivatormolekül in diesen Raum gelangt, kommt es zu einer Allosterie im Mediator, die es den GTFs und anderen verwandten Proteinen erleichtert, ihre Funktionen auszuführen. Folglich können Pol IIs die Transkription sehr schnell initiieren/reinitiieren (gemäß den Bedingungen II und III), wobei der RTOR die Menge der Transkripte steuert.

Dieser Mechanismus legt nahe, dass die molekularen Interaktionen, an denen der Promotor beteiligt ist, eleganten dynamischen Prinzipien gehorchen. Der klammerartige Raum wird zwar vorübergehend gebildet, ist aber viel stabiler als die darin angesiedelten Aktivatoren. Die Aktivatoren können selbst während kurzer Episoden, in denen ihre Konzentration nahezu unverändert bleibt, viele Male in den Raum hinein- und wieder herauswandern; daher kann die Konzentration der Aktivatoren durch RTOR zeitnah dargestellt werden. Da der Mediator die Information über die Allosterie überträgt und die Rate der Transkriptions-Reinitiation viel größer ist als die Zyklusrate der Aktivatoren, wird der RTOR-Code effektiv zur Steuerung der mRNA-Synthese eingesetzt. Mit einem Wort, der klammerartige Raum ist die strukturelle Grundlage für zuverlässige transkriptionelle Reaktionen. Die stochastische Natur der molekularen Interaktionen stellt kein Hindernis dar, sondern wird vollständig genutzt, um die Transkription zuverlässig zu induzieren; dies hängt weitgehend von den unterschiedlichen Stabilitätsgraden der Komponenten des TA ab, die mehrere Größenordnungen umfassen. Die obigen Argumente werden durch experimentelle Daten gestützt, und die typischen Zeitskalen sind wie folgt: die Halbwertszeit des klammerartigen Raums beträgt etwa 5 Minuten11, die Aufenthaltszeit von Aktivatoren im Raum liegt im Bereich von Sekunden bis zu einigen zehn Sekunden10, Allosterie tritt normalerweise innerhalb von Millisekunden bis höchstens 1 Sekunde auf23,24,25 und es dauert nur einige Sekunden, um ein Transkript neu zu initiieren (siehe S3 der ergänzenden Informationen).

Validierung des Mechanismus durch numerische Simulationen

Um den vorgeschlagenen dynamischen Mechanismus weiter zu verifizieren, haben wir ein vereinfachtes stochastisches Modell der Gentranskription mit physiologisch realistischen Parametern erstellt (siehe Abb. S4 und S4 in den ergänzenden Informationen). Dieses Modell stellt die wichtigsten Zustandsübergänge der TA dar und beschreibt auch einfach die damit verbundene Chromatindynamik, wodurch die Transkriptionsantwort auf Transkriptionsaktivatoren charakterisiert werden kann. Im Folgenden bezeichnen „Input“ und „Output“ die Kernkonzentration der Aktivatoren bzw. die Menge an Genprodukten, mRNA oder Protein.

Zunächst untersuchen wir die zeitliche Entwicklung der Anzahl der zellulären mRNAs bei konstantem Inputniveau (Abb. 3a). Bemerkenswert ist, dass mRNAs in einer burstartigen Weise produziert werden, was mit der vorherrschenden Ansicht übereinstimmt14,27,28,29,30,31,32. Bei schwachen Inputs wird ein Allel transkribiert, während das andere in einer diploiden Zelle stumm ist, so dass das Bursting-Phänomen offensichtlich ist. Bei hochgradigen Inputs hingegen platzen beide Allele häufig, so dass die Summe fast konstant wird. Dies deutet darauf hin, dass der Phänotyp der anhaltend erhöhten Transkriptionsantworten bei hohen Inputs beobachtet werden kann14.

Eine kürzlich durchgeführte experimentelle Analyse schloss die Möglichkeit aus, dass die Chromatinumgebung eine zentrale Rolle bei der Gestaltung des transkriptionellen Bursts spielt32. Hier zeigen wir, dass ein Burst von Transkripten durch anhaltende Reinitiation durch Pol II entsteht, wenn der klammerartige Raum von den Aktivatoren besetzt ist (Abb. 4). Das heißt, die Initiation der mRNA ist selbst burstartig. Das Bursting ist kein bloßes Rauschen, sondern eine direkte Manifestation des RTOR-Codes, der die Konzentration der Aktivatoren darstellt und die mRNA-Produktion steuert.

Zweitens untersuchen wir das durchschnittliche Input/Output-Verhältnis der Transkriptionsantwort. Der durchschnittliche Output ähnelt einer Hill-Funktion des Inputs, die in der Systembiologie häufig zur Modellierung der Genexpression verwendet wird3,33,34 (Abb. 3b). Die Kurve der Standardabweichung SDout des Outputs gegenüber dem Input ist annähernd glockenförmig (Abb. 3c). Die Intensität des intrinsischen Rauschens, definiert als das Verhältnis von SDout zum mittleren Output35, ist umgekehrt mit dem Input korreliert (Inset in Abb. 3b). Darüber hinaus sind die oben genannten Merkmale unempfindlich gegenüber leichten Schwankungen des Inputs (d. h. extrinsisches Rauschen) (Abb. S5), was auf die Robustheit der transkriptionellen Reaktion auf Rauschen hinweist. All diese Ergebnisse stehen in guter Übereinstimmung mit den experimentellen Messungen sowohl bei Saccharomyces cerevisiae36 als auch bei Drosophila-Embryonen37. Insbesondere ist die linke Seite der SDout-Kurve niedriger als ihre rechte Seite; dieses Merkmal stimmt quantitativ fast mit den experimentellen Daten37 überein (siehe S5 der ergänzenden Informationen für weitere Diskussionen). Im Gegensatz dazu würden Abweichungen von den oben vorgeschlagenen dynamischen Prinzipien (einschließlich der Umstände, unter denen der Zyklus der Aktivatoren langsam ist, der Gerüstkomplex/klammerartige Raum nicht stabil ist oder/und die Rate der transkriptionellen Reinitiation niedrig ist) die Fähigkeit der TA verringern, zuverlässig auf den Input zu reagieren (Abb. S6).

Die in Drosophila-Embryonen beobachtete Input/Output-Beziehung wurde vermutlich durch die maximale Ausnutzung der Grenze molekularer Wechselwirkungen realisiert37,38,39. Die Eigenschaften solcher mikroskopischen Interaktionen werden integriert und makroskopisch als SDout dargestellt. Die SDout-Kurve ist im Vergleich zur SDin-Kurve insgesamt immer noch glockenförmig (vgl. Abb. 1d). Das heißt, die Signatur des RTOR-Codes kann direkt auf den Ausgang übertragen werden. Dies bestätigt, dass die zeitliche Besetzungsrate der Aktivatoren tatsächlich zur Regulierung der Transkription ausgenutzt wird und der Mediator die Information durch Allosterie überträgt. Andererseits ist die SDout-Kurve asymmetrisch, wobei die rechte Seite höher ist als die linke. Der Grund dafür ist offensichtlich. Wenn der Input sehr hoch ist, wird der Enhancer fast die ganze Zeit von den Aktivatoren gebunden, so dass die Fluktuationen hauptsächlich die dynamischen Eigenschaften des SCF und die transkriptionelle Reinitiation durch Pol IIs widerspiegeln. Unsere weiteren Simulationen zeigen, dass die rechte Seite der SDout-Kurve abfällt, wenn die Stabilität des SCF oder die Rate der transkriptionellen Reinitiation erhöht wird; nur wenn deren Stärke über die physiologischen Bereiche hinaus erhöht wird, kann die Kurve symmetrisch werden (Abb. S6F). Dies bestätigt auch, dass sowohl P(S) als auch tatsächlich groß genug sind. Daher sollten die Eigenschaften von SDout den mikroskopischen Transkriptionsmechanismus schlüssig beweisen.

Drittens untersuchen wir die Verteilung der mRNA-Spiegel über eine große Zellpopulation, die dem gleichen Input ausgesetzt ist (Abb. 3d). Bei kleinen Inputs ist das Bursting-Phänomen besonders offensichtlich, und die meisten Zellen haben keine oder nur wenige mRNAs. Dies stimmt mit den experimentellen Beobachtungen überein27,30,31. Mit zunehmendem Input wird die Verteilung jedoch allmählich normal. Für aon/aoff >1 wird die Verteilung mit zunehmendem Input schärfer. Diese Ergebnisse müssen noch experimentell bestätigt werden.

Viertens simulieren wir die transkriptionelle Reaktion auf einen periodisch variierenden Input. Der mikroskopische Prozess an einem Promotor ist ziemlich dynamisch und stochastisch, wobei verschiedene Komponenten der TA unterschiedliche Stabilitäten aufweisen (Abb. 3e). Die Menge der mRNAs kann jedoch dem Input folgen. Diese Ergebnisse stimmen gut mit den FRAP-Ergebnissen überein, d. h. die TA ist ein hochdynamischer Apparat8,10,11,22. Andererseits zeigen Simulationen von Chromatin-Immunpräzipitations-Assays (ChIP), die die zeitliche Entwicklung der Verteilung der verschiedenen Zustände des Promotors in einer Zellpopulation charakterisieren, eine starke Regelmäßigkeit in den Verteilungen (Abb. 3f). Die Muster sowohl der Aktivatoren, die an den Enhancer binden, als auch der SCF- und Pol-II-Bindung an den Promotor folgen dem Input. mRNA-Transkripte werden in Phase mit dem Input produziert, während Histone den Promotor in umgekehrter Phase besetzen. Alle diese Ergebnisse stimmen gut mit den experimentellen Befunden überein22,40. Die beobachteten Diskrepanzen zwischen den Ergebnissen von FRAP- und ChIP-Experimenten können daher auf unterschiedliche Auflösungen bei den Messungen zurückzuführen sein. Bei ChIP-Messungen werden molekulare Interaktionen sowohl zeitlich als auch über die Zellpopulation hinweg integriert, während FRAP die momentanen Interaktionen genauer wiedergibt. Darüber hinaus ist die transkriptionelle Reaktion auf den zeitlich variierenden Input robust gegenüber extrinsischem Rauschen, aber empfindlich gegenüber zusammengesetzten Inputsignalen, und Abweichungen von den dynamischen Prinzipien (wie in Fällen mit niedriger Zyklusrate der Aktivatoren, instabilem Gerüstkomplex/klammerartigem Raum oder/und niedriger Rate der transkriptionellen Reinitiation) würden die Reaktionsfähigkeit verringern (siehe Abb. S7 und S8).