ABSTRACT

Vor der Ligation muss jedes Okazaki-Fragment, das in Eukaryoten auf dem zurückbleibenden Strang synthetisiert wird, nukleolytisch verarbeitet werden. Die Nuklease-Spaltung findet im Zusammenhang mit 5′-Flap-Strukturen statt, die durch die Strangverschiebungssynthese der DNA-Polymerase delta erzeugt werden. Mindestens drei DNA-Nukleasen: Rad27 (Fen1), Dna2 und Exo1, sind an der Verarbeitung von Okazaki-Fragment-Flaps beteiligt. Allerdings sind weder die Beiträge der einzelnen Nukleasen zur Lagging-Strang-Synthese noch die Struktur der in ihrer Abwesenheit gebildeten DNA-Zwischenprodukte in vivo klar definiert worden. Durch die bedingte Deletion von Lagging-Strang-Nukleasen und die direkte Analyse von Okazaki-Fragmenten, die in vivo in S. cerevisiae synthetisiert werden, führen wir eine systematische Bewertung der Auswirkungen von Rad27, Dna2 und Exo1 auf die Lagging-Strang-Synthese durch. Wir stellen fest, dass Rad27 den Großteil der Lagging-Strand Flaps verarbeitet, mit einem signifikanten zusätzlichen Beitrag von Exo1, aber nicht von Dna2. Wenn die Nuklease-Spaltung beeinträchtigt ist, beobachten wir eine Verringerung der Strangverschiebungssynthese im Gegensatz zur weit verbreiteten Erzeugung langer 5′-Lappen aus Okazaki-Fragmenten, wie sie von einigen Modellen vorhergesagt wird. Mit Hilfe von Konstrukten, die den Zellzyklus einschränken, zeigen wir außerdem, dass sowohl die nukleolytische Verarbeitung als auch die Ligation von Okazaki-Fragmenten von der DNA-Replikation abgekoppelt und verzögert werden können, bis die Synthese des größten Teils des Genoms abgeschlossen ist.