Zellkulturreagenzien

Ein Glycerinbestand des humanen Akt1 ORF wurde als pENTR221 Vektor von GE Dharmacon (Human Akt1 ORF Clone ID 100067600) bezogen. Der modifizierte Zielvektor (pcDNA/FRT/TO), der den SH-Tag enthält, war ein großzügiges Geschenk von Dr. Matthias Gstaiger (Institut für Molekulare Systembiologie, ETH Zürich, Zürich, Schweiz). Flp-In TREx HEK293 Zellen (#R780-07), LR Clonase II Enzymmix (#11791-100), pOG44 Vektor (#V6005-20), Zeocin (#46-0509), Blasticidin S (#R210-01), Hygromycin B (#10687-010), Tet (#550205) und Dynabeads Protein A (#100.02D) wurden von Invitrogen bezogen. Xtremegene 9 (#06365787001) wurde von Roche erworben. DMEM (#12430-054) und RPMI 1640 (#22400-089) wurden von GIBCO bezogen. Trypsin (#CC5027.010L) wurde von Genetics bezogen. Normale FBS (#SH30070.03) sowie Tet-gescreente FBS (#SH30070.03T) wurden von Hyclone bezogen. Aphidicolin (#A0781-10MG), Nocodazol (#M1404-10MG), Propidiumiodid (#P4170-250 mg) und Lys C-Protease (#P3428) wurden von Sigma bezogen. SILAC-Etiketten wurden von Cambridge Isotope Laboratories, Inc. beschafft. Proteaseinhibitor-Cocktail (100X) (#78429) und Pierce Anti-HA-Agarose-Perlen (#26182) wurden von Thermo Scientific bezogen. MagStrep ‚Typ 2HC‘ Beads (#2-1612-002) wurden von IBA BioTagnology bezogen. Bioconcept Labs Pvt Ltd, Gurgaon, Indien, synthetisierte das HA-Peptid. Die Nitrocellulosemembran (#RPN303E) wurde von GE Healthcare bezogen. Trypsin-Protease (#4370282) wurde von AB Sciex beschafft. Full range rainbow protein molecular weight marker (#RPN800E) wurde von Amersham bezogen. siRNAs, Dharmafect Transfection Reagent (#T-2001-03), RNase Free Water (#B-003000-WB-100), 5X siRNA buffer (#B-002000-UB-100) wurden von Dharmacon bezogen. RNase A (#19101) stammte von Qiagen.

Antikörper für Western Blot

Die in der vorliegenden Studie verwendeten Antikörper waren: anti-HA (#SC-7392; Maus monoklonal, Verdünnung 1:3000); anti-AKT1 (#SC-5298; Maus monoklonal, Verdünnung 1:1000) und Anti-GAPDH (#SC-25778; Kaninchen polyklonal, Verdünnung 1:1000) von Santa Cruz; Anti-CDC2 (#77055; Kaninchen polyklonal, Verdünnung 1:1000); Anti-CCNB1 (#4138; Kaninchen polyklonal, Verdünnung 1:1000) von Cell Signalling Technology; anti-BUB3 (#ab133699; Kaninchen monoklonal, Verdünnung 1:10000); anti-API5 (#ab56392; Maus monoklonal, Verdünnung 1:1000) und anti-SH3PX1 (#EPR14399; Kaninchen monoklonal, Verdünnung 1:2000) von Abcam; sekundäre Antikörper wurden von Licor Biosciences-Odyssey-Ziegen-Anti-Maus (#926-32210, Verdünnung 1:15000) und Odyssey-Ziegen-Anti-Kaninchen (#926-32211, Verdünnung 1:15000) beschafft.

Generierung einer stabilen Zelllinie

In dieser Studie wurde ein gateway-kompatibler Akt1-Eingangsvektor (pENTR221) verwendet, um ein Expressionskonstrukt durch LR-Rekombinationsreaktion in Gegenwart eines geeigneten Zielvektors (pcDNA/FRT/TO) zu erzeugen. Der Zielvektor wurde so modifiziert, dass er ein Strep-HA (SH)-Tag enthält, das ein Streptavidin-bindendes Peptid (Strep) und ein Hämagglutinin (HA)-Epitop-Tag enthält. Dieser SH-Tag wurde schließlich verwendet, um Akt1 und seine interagierenden Partner selektiv aus komplexen Zelllysaten herauszuziehen. Um eine induzierbare Akt1-Expressionszelllinie zu erzeugen, wurde das Expressionskonstrukt mit pOG44-Rekombinase in Flp-In TREx HEK293-Zellen kotransfiziert, die den Tet-Repressor stabil exprimieren. Die Transfektion wurde durch das Xtremegene 9 Transfektionsreagenz erleichtert. Zellen, die das Akt1-Konstrukt exprimieren, wurden über einen Zeitraum von 15-20 Tagen in Hygromycin-B (75 µg/ml) enthaltendem RPMI-Medium selektiert, das mit 10 % Tet-gescreentem FBS ergänzt wurde.

Die für eine optimale Akt1-Expression erforderliche Tet-Konzentration wurde durch Induktion der Akt1-Expression in einem Bereich von Tet-Konzentrationen (0,1 µg/ml bis 5 µg/ml) bestimmt, und die Proteinexpression von Akt1 wurde in Gegenwart und Abwesenheit von Tet unter Verwendung von Anti-Akt1- und Anti-HA-Antikörpern überwacht. Tet wurde dem Kulturmedium alle 24 Stunden zugesetzt, um eine konstante Akt-Expression aufrechtzuerhalten.

PDT-Experiment

PDT für HEK293-Zellen wurde in normalen und Akt1-überexprimierenden Zellen über einen Zeitraum von 72 Stunden nach der anfänglichen Verabreichung von Tet beobachtet. Für jeden Beobachtungszeitpunkt wurde ein paralleler Satz von 104 normalen und Akt1-überexprimierenden HEK293-Zellen in dreifacher Ausfertigung in einer 96-Well-Platte in 100 µl DMEM-Medium mit 10% Serum ausgesät. 24 Stunden nach der Aussaat wurde dem Kulturmedium Tet zugesetzt, und nach einem weiteren Inkubationsintervall von 24 Stunden wurden die Zellen zum Zeitpunkt 0 geerntet. Danach wurde eine Gruppe von Zellen in Parallelkultur alle 24 Stunden bis zu 72 Stunden geerntet. Die PDT wurde durch Zählen der Zellen zu jedem Zeitpunkt mittels Trypanblau-Färbemethode bestimmt.

SILAC-Markierung zur Differenzierung des zellzyklusphasenspezifischen Akt1-Interaktoms

Akt1-überexprimierende HEK293-Zellen wurden expandiert und in SILAC-Medien kultiviert, die „leichte“ (K0R0), „mittlere“ (K6R6) oder „schwere“ (K8R10) Isotope von Lysin (K) und Arginin (R) für mindestens fünf Zellverdoppelungen enthielten, um eine vollständige Inkorporation der Markierung zu ermöglichen. Bei 70 % Konfluenz wurde Tet (1 µg/ml) zu den Medien hinzugefügt, um die Akt1-Expression zu induzieren. K0R0-markierte Zellen wurden in der G0-Phase arretiert, indem sie über Nacht einer Serumstarvation unterzogen wurden; dies ist eine weit verbreitete Methode, um Zellen in der G0-Phase zu arretieren42. Zu diesem Zweck wurde das normale vollständige Kulturmedium durch RPMI ohne Serum ersetzt, und die Zellen wurden 16-18 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 in Kultur gehalten. K8R10-markierte Zellen wurden in der G1/S-Phase arretiert, indem die Zellen über Nacht in Gegenwart von 5 µg/ml Aphidicolin, einem reversiblen Inhibitor der eukaryotischen DNA-Kernreplikation, kultiviert wurden43. Um die G2-Phase zu stoppen, wurden 400ng/ml Nocodazol zu den Kulturmedien der K6R6-markierten Zellen gegeben und die Inkubation wurde 16-18 Stunden lang fortgesetzt, bevor die Zellen pelletiert wurden. Nocodazol stört die Polymerisation von Mikrotubuli, wodurch die Zellen in der G2/M-Phase arretiert werden44. Die arretierten Zellen wurden trypsinisiert und mit der Trypanblau-Färbemethode separat gezählt. Die in verschiedenen Zellzyklusphasen arretierten Zellen wurden dann durch Zentrifugation bei 1500 U/min für 10 Minuten pelletiert. Für jede Zellzyklusphase wurden mehrere Zellpellets hergestellt und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.

SH-tagged Affinitätsreinigung

Gleiche Anzahl von Akt1-überexprimierenden Zellen, die in den Phasen G0, G1/S und G2 verhaftet waren, wurden im Verhältnis 1:1:1 gemischt und 1 Stunde lang in IP-Puffer (150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH7,5; 1% NP-40; 1X Proteaseinhibitor-Cocktail und 1 mM PMSF) auf Eis lysiert. Das Zelllysat wurde durch Zentrifugation bei 10.000 rpm für 15 Minuten bei 4 °C von Trümmern befreit. Akt1-Proteinkomplexe wurden selektiv in parallelen Sets aufgereinigt, indem Strep- und HA-Tags gleichzeitig eingesetzt wurden, wie in den Anleitungen der jeweiligen Kits beschrieben. Kurz gesagt: Strep-markierte Akt1-Proteinkomplexe wurden mit 100 µl Streptactin-Magnetbeads gemischt und 1 Stunde lang auf einem Rotationsschüttler bei 4 °C inkubiert. Alle unspezifischen Interaktoren wurden in fünf aufeinanderfolgenden Waschschritten mit fünf Bead-Volumina Streptactin-Waschpuffer weggewaschen. Das Akt1-Protein und seine Interaktoren wurden schließlich in zwei Elutionsschritten mit 125 µl Strep-Elutionspuffer pro Elution (Invitrogen) eluiert. Für die Aufreinigung von HA-markierten Akt1-Proteinkomplexen wurden gereinigte Zelllysate mit 50 µl vorgewaschenen HA-Agarose-Perlen 2 Stunden lang bei 4 °C auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Nach drei schnellen Waschungen mit zehn Bead-Volumina TBS-T-Puffer wurden die Akt1-Proteinkomplexe dreimal mit 50 µl HA-Peptid (250 µg/ml) eluiert. Die oben genannten Reinigungsschritte wurden für drei solche biologischen Replikate durchgeführt, um das Akt1-Protein und seine Interaktionspartner zu reinigen, und die Strep- und HA-Eluate für jedes Replikat wurden gepoolt, gefriergetrocknet und bei -80 °C bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt.

Proteinverdau und Probenvorbereitung für LC-MS/MS

Alle drei biologischen Replikate wurden für den Proteinverdau getrennt verarbeitet. Die lyophilisierte Probe wurde mit 40 µl 100 mM Ammoniumbicarbonat versetzt, gut geschüttelt und anschließend mit 2 µl Denaturierungspuffer (AB Sciex) versetzt. Die Proben wurden mit 4 µl Reduktionsmittel (AB Sciex) für 1 Stunde bei 60 °C reduziert. 2 µl Cystein-Blockierungsreagenz wurden für 10 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben, um reduzierte Cysteinreste zu blockieren. Der Proteinverdau wurde durch Zugabe von 5 µl 0,1 µg/µl Endo-Proteinase Lys C eingeleitet. Die Proben wurden 4 Stunden lang im Wasserbad bei 37 °C inkubiert. Nach einem kurzen Schleudern wurde 1 µl Trypsin (1 µg/µl) zu den Proben gegeben und die Inkubation für weitere 12-16 Stunden bei 37 °C fortgesetzt. Der Proteinverdau wurde durch Zugabe eines Tropfens Ameisensäure (FA) beendet.

Die angesäuerten Proben wurden gefriergetrocknet und einer Peptidreinigung mit Monospin-C-18-Säulen unterzogen. Vor der Verwendung wurden die C-18-Säulen mit Methanol und Wasser konditioniert und anschließend mit 3 % ACN in 0,1 % FA äquilibriert. Die gefriergetrockneten Proben wurden in 3 % ACN in 0,1 % FA gelöst und auf die C-18-Säulen geladen, wo sie 10 Minuten lang gebunden wurden. Die Proben wurden zweimal durch die Säulen geleitet, um eine vollständige Bindung sicherzustellen. Nach 10 kräftigen Waschungen mit 3% ACN in 0,1% FA wurden die verdauten Peptide zunächst in 40% ACN eluiert, gefolgt von zwei Elutionen in 60% ACN. Schließlich wurden die drei Eluate für jedes Replikat gepoolt und lyophilisiert.

Die eluierten Peptide wurden in 500 µl 5 mM Ammoniumformiat (pH 2,5) in 30 % ACN wieder aufgelöst und vorsichtig vortexen. Die Kationenaustauscherkartusche wurde vor dem Laden der Probe fixiert und konditioniert. Im Anschluss an die Probenbeladung wurde die Kartusche dreimal mit 5 mM Ammoniumformiat (1 ml) gewaschen. Die Peptide wurden zweimal mit 400 µl 500 mM Ammoniumformiat (pH 2,5) in 30 % ACN pro Elution erneut eluiert, und die Eluate wurden für jedes Probenreplikat gepoolt und lyophilisiert.

Massenspektrometrie-Versuchsaufbau und statistische Begründung

LC-MS/MS-Analyse

Alle Proben wurden mittels Nano-Flüssigkeitschromatographie auf einem Nanoflex-System (Eksigent Technologies, AB Sciex) analysiert, das mit einem Triple-TOF 5600-Massenspektrometer (AB Sciex; Concord, Kanada) gekoppelt war. Jedes biologische Replikat wurde zweimal als technische Replikate injiziert. Das System wurde mit einem binären Phasengradienten betrieben, mit Lösungsmittel A (2% ACN in 0,1% FA) und Lösungsmittel B (98% ACN in 0,1% FA). Um eine optimale Reproduzierbarkeit der Probenzufuhr zu gewährleisten, wurde der Autosampler im Vollinjektionsmodus betrieben, wobei die 1 µl-Schleife mit 3 µl Probe überfüllt wurde. Für die Messungen jeder Probeninjektion wurden die Peptide auf einer cHiPLC-Trap, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 0,5 mm × 200 µm (Eksigent) eingefangen und auf einer cHiPLC-Säule, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 15 cm × 75 µm (Eksigent) bei einer Flussrate von 300 nl/Minute unter Verwendung eines linearen Gradienten getrennt: 5-60% Lösungsmittel B in 80 Minuten, 60-90% für 2 Minuten. Die Säule wurde durch Waschen mit 90%igem Lösungsmittel B für 6 Minuten regeneriert und mit 5%igem Lösungsmittel B für 22 Minuten re-equilibriert.

Das Massenspektrometer war mit einer Nano Spray Ionenquelle (AB Sciex) gekoppelt, die von der Analyst Software (v.1.6) gesteuert wurde. Die Ionenquelle war mit einem 10 μm SilicaTip Elektrospray PicoTip Emitter (AB Sciex) ausgestattet und die eluierten Peptide wurden mit folgenden Ionenquellenparametern überwacht: IHT = 130°, ISVF = 2100 v, GS1 = 20, Vorhanggas = 25. Das Massenspektrometer wurde im IDA-Modus (Information Dependent Acquisition) Top10 und im Hochempfindlichkeitsmodus mit einer Akkumulationszeit von 500 bzw. 200 ms für die MS1- und MS2-Scans und einem dynamischen Ausschluss von 12 s betrieben, was zu einem Gesamtarbeitszyklus von ~2,55 s führte. Die Massenspektrometeranalyse wurde mit TOF-MS1- und MS2-Survey-Scans im Bereich von 350-1250 bzw. 140-1600 m/z durchgeführt. Die Rolling collision energy wurde automatisch durch das IDA Rolling collision energy parameter script gesteuert. Zu den Auswahlkriterien für das zu fragmentierende Mutterion gehörten die Intensität – die Ionen mussten größer als 150 cps sein -, eine Massentoleranz von 50 mDa und ein Ladungszustand von +2 bis +5. Eine automatische Kalibrierung der Spektren erfolgte nach der Erfassung von jeweils 2 Proben unter Verwendung dynamischer LC-MS- und MS/MS-Erfassungen von 25 fmol β-Galaktosidase.

Datenverarbeitung und Analyse

Die MS-MS-Erfassung von Akt1 und seinen interagierenden Proteinpartnern erfolgte in 3 verschiedenen Zellzyklusphasen, d.h. G0-, G1/S- und G2-Phase. SILAC-markierte Zellen, die jede Phase repräsentieren, wurden in drei getrennten Gruppen zusammengefasst und als biologische Replikate untersucht. Die Erfassung jedes biologischen Replikats führte zu 2 wiff- und 2 wiff.scan-Dateien, die die technischen Replikate repräsentieren. Die Wiff-Dateien wurden wiederum für jedes biologische Replikat gepoolt, bevor sie mit der UniProtKB/SwissProt Human-Datenbank (Stand April 2015) unter Verwendung der Protein-Pilot-Software, Version 4.5 (Revisionsnummer 1656), durchsucht wurden. Die Referenzdatenbank umfasste 20 204 Proteineinträge in der angegebenen Version. Die Protein-Pilot-Suche basierte auf dem Paragon-Algorithmus, einem Teil der Standardstatistiken der Software. Für die Paragon-Suche wurden folgende Einstellungen verwendet: (a) Spezies als Homo sapiens, (b) Lys C und Trypsin als Enzymkategorien für verschiedene Läufe, (c) Maximale verpasste Spaltungen = 2, (d) Feste Modifikationen als SILAC-Markierungen – K6R6 und K8R10; Cystein-Alkylierung durch Methylmethansulfonat (MMTS), (e) Variable Modifikationen als Oxidation am Methionin, was eine Standardoption in Proteinpilot ist, (f) Identifizierung, SILAC (Lys + 6, Arg + 6) und SILAC (Lys + 8, Arg + 10) als Probentypen, und (g) „Search Effort“-Parameter „Thorough ID“, der uns eine breite Suche nach verschiedenen Proteinmodifikationen ermöglicht, (h) Massentoleranz für Vorläufer- und Fragment-Ionen waren 0.05 bzw. 0,1 Da. Für jedes biologische Replikat pro SILAC-Marke wurden Lys C- und Trypsin-verdaute Dateien erstellt. Die folgenden Parameter wurden zum Filtern der Daten verwendet, um einen zuverlässigen Datensatz für die anschließende Analyse zu erhalten: (a) Es wurde ein automatischer Korrekturalgorithmus für das Verhältnis von schweren zu leichten Ionen angewendet. Er korrigiert die ungleiche Vermischung während der Kombination der verschiedenen markierten Proben in einem Experiment und beseitigt jegliche experimentelle oder systematische Verzerrung. Der Auto-Bias-Faktor erhöht die Genauigkeit der Quantifizierung, indem er die Schwankungen der ursprünglichen Proteinmengen normalisiert45. (b) Proteine mit einer globalen Falschentdeckungsrate (FDR) von 1 % gegenüber dem Fit (G-FDR-fit) wurden ausgewählt. Die FDR-Analyse wurde mit der Proteomics Performance Evaluation Pipeline Software (PSPEP) durchgeführt, die zusammen mit der Protein-Pilot-Software installiert wird; (c) der Schwellenwert für das minimale Proteinkonfidenzniveau wurde auf 95 % festgelegt; (d) Identifizierung von mindestens einem einzigartigen Peptid mit 95 % Konfidenz in allen drei Replikaten.

Die Listen der Proteine, die nach dem Lys C- und Trypsin-Verdau gewonnen wurden, wurden pro biologischem Replikat gepoolt. Die Quantifizierungsverhältnisse zwischen mittelschweren und schweren SILAC-markierten Proteinen im Vergleich zu ihren leichteren Gegenstücken wurden gemittelt. Anschließend erhielten wir drei Proteinlisten pro SILAC-Markierung – K0R0, K6R6 und K8R10. Anschließend wurde eine gemeinsame Liste der identifizierten Proteine erstellt; Die quantitative Schätzung wurde manuell kuratiert, indem die Dateien von drei biologischen Replikaten für jede SILAC-Bedingung zusammengeführt wurden. Proteine, die in allen drei Replikatsätzen identifiziert wurden, wurden für die nachfolgende Analyse beibehalten, und die quantitativen Verhältnisse zwischen mittleren und schweren Markierungen im Vergleich zu leichten Markierungen für diese Proteine wurden gemittelt. Eine endgültige kombinierte Datei wurde dann für K0R0 (G0-Phase), K6R6 (G2-Phase) und K8R10 (G1/S-Phase) erstellt. Ein Protein qualifizierte sich nur dann für die endgültige Liste der Akt1-Interaktoren, wenn es in allen 3 Replikatsätzen für jede der Zellzyklusphasen identifiziert wurde. Proteine, die zwar identifiziert, aber nicht in allen drei Replikaten quantifiziert wurden, erhielten einen Quantifizierungswert von 0,01 (Minimum) oder 100 (Maximum), nachdem sie in die Peptid-SILAC-Verhältnisse eingefügt worden waren.

Um die Liste der Akt1-Interaktoren weiter von unspezifischen Interaktionen mit der Affinitätsmatrix oder dem Tag an sich zu bereinigen, wurde SH-markiertes GFP in HEK293-Zellen überexprimiert. Die Interaktionspartner des GFP-Proteins wurden selektiv eluiert, wie für Akt1-Proteinkomplexe beschrieben. Proteine, die sich mit dem zellzyklusphasenspezifischen Akt1-Interaktom überschnitten, wurden als unspezifische Proteine aus der Liste der Akt1-Interaktoren entfernt. Auf diese Weise erhielten wir schließlich einen zuverlässigen Datensatz von Interaktionspartnern für Akt1. Eine Zusammenfassung der Informationen über die Akt1-interagierenden Proteine und ihre Quantifizierungsschätzungen sind in der ergänzenden Tabelle 3 zu finden. Durch Division mit dem Akt1-Verhältnis in der jeweiligen Phase wurden die quantitativen Verhältnisse für alle Akt1-Interaktoren normalisiert. Dies ergab eine Einheitlichkeit von Akt1 als 1 in den Phasen G0, G1/S und G2.

Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western Blotting

Aus der Liste der identifizierten Akt1-Interaktoren wurden CDK1, CCNB1, BUB3, API5 und SH3PX1 zufällig ausgewählt, um ihre Assoziation mit Akt1 durch Western Blotting zu validieren. Das Pellet von asynchronisierten Akt1-exprimierenden Zellen wurde in IP-Puffer lysiert und einer Affinitätsreinigung mit SH-Tag unterzogen, wie zuvor beschrieben. Die Eluate wurden gepoolt und in 1X SDS-Probenpuffer verdünnt, 10 Minuten lang erhitzt und auf 10% SDS-PAGE aufgelöst. Die Proteinbanden wurden auf eine Nitrocellulosemembran übertragen und diese wurde mit 1:1 Odyssey-Blocking-Puffer blockiert: PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend wurde die Membran geschnitten, um Proteine unterschiedlicher Größe mit den entsprechenden primären Antikörpern zu sondieren und zusammen mit dem Anti-HA-Antikörper zu validieren. Die Verdünnung des primären Antikörpers wurde in Odyssey-Puffer hergestellt: PBST hergestellt und über Nacht bei 4 °C auf einem Schüttler inkubiert. Nach gründlichem Waschen wurden die Blots mit den entsprechenden IR-markierten Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpern in einer Verdünnung von 1:15000, verdünnt in Odyssey-Puffer: PBST. Die Banden wurden mit dem Odyssey-Infrarotscanner detektiert.

Die umgekehrte Co-Immunpräzipitation wurde ebenfalls mit Dynabeads Protein A durchgeführt. Die zuvor detektierten Akt1-Interaktoren wurden als Köderproteine verwendet, und Akt1 wurde als ihr Interaktionspartner mit einem Anti-Akt1-Antikörper untersucht. Die Antikörper gegen die ausgewählten Akt1-Interaktoren wurden mit 50 µl Dynabeads in separaten Röhrchen in einer Konzentration von 1:20-1:70 gemischt und in 200 µl PBST verdünnt. Die Bead-Antikörper-Mischungen wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Bead-Antikörper-Komplexe wurden mit einem Magnetseparator pelletiert und zum Waschen in 200 µl PBST resuspendiert. Anschließend wurden 250 µl Lysat in jedes Röhrchen gegeben und 2 Stunden lang bei 4 °C auf einem Rotationsschüttler bebrütet. Die Beads wurden zusammen mit den jeweiligen Antikörper-Antigen-Komplexen erneut pelletiert und dreimal mit je 200 µl PBST gewaschen. Dann wurden die Beads 10 Minuten lang in 50 µl 1X SDS-Probenpuffer gekocht und anschließend abgekühlt. Der Überstand wurde auf 10%ige SDS-PAGE aufgetragen und mittels Western Blotting untersucht. Anti-Akt1-Antikörper wurden verwendet, um nach Akt1 in der Elution von API5, CCNB1, CDK1, BUB3 und SH3PX1 zu suchen.

GO-Klassifizierung

GO-Klassen, die die Funktion jedes Akt1-Interaktors darstellen, wurden aus UniProt (http://www.uniprot.org/) und EnrichR-Datenbanken (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/) bestimmt. Nach einer umfangreichen manuellen Kuration wurden die identifizierten Akt1-Interaktoren in drei große Funktionsklassen eingeteilt, nämlich Proliferation und Überleben, Stoffwechsel und Proteinsynthese. Die restlichen Interaktoren wurden als eine gemeinsame Klasse mit der Bezeichnung „andere“ dargestellt, die Proteine mit Funktionen wie Transport, Hämatopoese usw. umfasste.

Gen-Knockdown mit siRNA

Standardisierung

Um die optimale siRNA-Konzentration für die Transfektion zu bestimmen, wurden 1,2 × 105 HEK293-Zellen in einer 12-Well-Platte ausgesät. siRNA gegen PLK1 wurde in allen Knockdown-Assays als positive Kontrolle verwendet. Eine Reihe von siRNA-Konzentrationen von 10 nM bis 50 nM wurde mit dem Transfektionsreagenz dharmafect transfiziert, wie im Protokoll des Lieferanten angegeben. Die Veränderungen der Proteinexpression wurden mittels Western Blotting nach 24 Stunden, 48 Stunden bzw. 72 Stunden untersucht (siehe ergänzende Abbildung 2). Einige weitere Zielmoleküle (SH3PX1, AKT1, CCNB1 und SLC25A5) wurden ausgeschaltet, und die Wirkung des Knockdowns wurde durch Western Blotting bestimmt. GAPDH wurde als Ladekontrolle verwendet.

Knockdown der Zielproteine

Proteine, die eine gestörte Assoziation mit Akt1 aufweisen, während die Zelle von der G0- in die G1/S-Phase des Zellzyklus übergeht, wurden in HEK293-Zellen einzeln ausgeschaltet und mittels FACS untersucht. Jede siRNA wurde in 1x siRNA-Puffer resuspendiert, um eine Stammkonzentration von 20 µM zu erhalten. Die Transfektion erfolgte in dreifacher Ausführung 24 Stunden nach der Zellaussaat, zusammen mit entsprechenden Positiv- und Negativkontrollen. Jede siRNA wurde auf eine Arbeitskonzentration von 25 nM in RPMI auf ein Endvolumen von 50 µl verdünnt und für 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur gehalten. Das Transfektionsreagenz wurde ebenfalls in RPMI auf ein Volumen von 50 µl verdünnt und für die Inkubation unter ähnlichen Bedingungen aufbewahrt. Sowohl siRNA als auch Transfektionsreagenz wurden vorsichtig gemischt, um Komplexe zu bilden, und die Inkubation wurde für weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das endgültige Volumen wurde mit 10 % serumhaltigem Medium auf 500 µl aufgefüllt. Diese Komplexe wurden dann vorsichtig auf die Zellen gegeben und die Inkubation bei 37 °C fortgesetzt. Das Zellkulturmedium wurde nach 24 Stunden durch frisches 10%iges Medium ersetzt. Schließlich wurde 48 Stunden nach der Transfektion die Transfektionseffizienz durch Beobachtung von siGLO unter dem Nikon Ti-Inversmikroskop bestimmt.

FACS-Aufnahme und -Analyse

48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen kurz zentrifugiert und das Medium abgesaugt. Die Zellen wurden mit 300 µl Propidiumjodidlösung, die 0,1 mg/ml Propidiumjodid (Sigma), 3 µl/ml Triton-X 100 (Sigma), 1 mg/ml Natriumzitrat (Sigma) und 20 µg/ml RNase (Sigma) enthielt, 30 Minuten lang bei 4 °C gefärbt. Die gefärbten Zellen wurden sofort in BD FACS-Röhrchen überführt und im BD FACS Canto erfasst.

Die erhaltenen Daten wurden mit der Software FlowJo analysiert. Die DNA-Histogramme wurden analysiert, um die Sub-G0-, G0/G1-, S- und G2/M-Populationen zu quantifizieren. Geringfügige Verschiebungen wurden in den G0/G1- und G2/M-Populationen beobachtet, weshalb diese Populationen manuell analysiert wurden.

PDT- und RT-Berechnung

PDT und RT in den G1-, S- und G2-Phasen des Zellzyklus wurden nach siRNA-Knockdown der Proteine berechnet, die eine gestörte Assoziation mit Akt1 in der G1/S-Phase aufweisen. Die PDT für die 23 Gene wurde zusammen mit den Kontrollen in HEK293-Zellen über einen Zeitraum von 72 Stunden überwacht. Dazu wurden 10 000 Zellen in einer 96-Well-Platte in 100 µl RPMI-Medium mit 10 % Serum ausgesät. Die siRNA-Transfektion erfolgte am nächsten Tag in dreifacher Ausführung für jedes Zielprotein und wurde als 0-Stunden-Zeitpunkt betrachtet. Die Zellzahlen wurden für unbehandelte HEK293-Zellen mit der Trypanblau-Färbemethode bestimmt. Nach 24 Stunden wurde das Zellkulturmedium, das die siRNA-Komplexe enthielt, durch frisches RPMI mit 10 % Serum ersetzt. Danach wurden die Zellen für jede der siRNA-transfizierten Zellen gezählt, um den 24-Stunden-Zeitpunkt zu repräsentieren. Anschließend wurde eine Reihe von Zellen, die parallel kultiviert wurden, geerntet und zu den Zeitpunkten 48 und 72 Stunden gezählt.

Nachdem die PDT für alle anvisierten gestörten Gene bestimmt worden war, wurde die RT (in Stunden) für jedes Gen in der G1-, S- und G2-Phase wie folgt berechnet:

where; % der Zellpopulation wurden durch FACS-Erfassung bestimmt.

Datenverfügbarkeit

Die Massenspektrometriedaten wurden als Datensatz „Defining the Akt1 interactome and delineating alterations in its composition as a function of cell cycle progression.“ bei ProteomeXchange über die PRIDE-Datenbank hinterlegt. Er ist öffentlich zugänglich über ProteomeXchange mit dem Identifikator ProteomeXchange: PXD005557. Der Datensatz besteht aus 12 Rohdateien (wiff und wiff.scan) und zugehörigen 18 Protein-Pilotdateien.