Abstract

Træer af Copaifera-slægten er hjemmehørende i de tropiske områder i Latinamerika og det vestlige Afrika. Copaifera sp. anvendes i vid udstrækning som et populært lægemiddel, og den har forskellige etnofarmakologiske indikationer, herunder gonoré, bronkitis, astma, hudsår, sår, halsbetændelse, livmoderinfektioner, generelle inflammationer, kræft og leishmanioser. Kaurenoesyre er en naturligt forekommende diterpen, der findes i Copaifera, og er blevet anvendt som antiinflammatorisk middel, til behandling af mavesår, leishmaniasis og kræft. I betragtning af at Ames-testen er et fremragende redskab til at vurdere sikkerheden af ekstrakter, olier og fytokemikalier isoleret fra lægeplanter, vurderer vi ud fra den det mutagene potentiale af fire arter, mellem oleoresiner (C. oblongifolia; C. langsdorffii) og bladekstrakter (C. lucens; C. multijuga), af Copaifera-slægten og også af kaurenoesyre, som er en af dens vigtigste forbindelser. Resultaterne viste, at Copaifera spp. og kaurenoesyre ikke inducerede en stigning i antallet af revertante kolonier uden mutagen virkning i eksperimenterne i alle de koncentrationer, der blev vurderet ved Ames-testen. De resultater, der er opnået i vores undersøgelse, støtter den sikre anvendelse af de udvalgte medicinske planter af Copaifera-slægten og af kaurenonsyre.

1. Indledning

Igennem historien har forskellige kulturer anvendt planter til medicinske formål. Planter har faktisk vist sig at være en kilde til lægemidler til behandling af et bredt spektrum af sygdomme. I dag spiller plantebaserede systemer fortsat en væsentlig rolle for sundheden, og interessen for fytomedicinske produkter er steget verden over, så meget at planter stadig undersøges som kilde til nye lægemidler.

Træer, der tilhører slægten Copaifera, er hjemmehørende i de tropiske områder i Latinamerika og det vestlige Afrika. Slægten Copaifera hører til familien Leguminosae og omfatter 72 arter. Der findes over 20 Copaifera-arter i Brasilien, hvor de kaldes “copaibeiras”, “pau d’óleo” eller “copaíbas” . Copaifera spp. anvendes i vid udstrækning i folkemedicinen. De har forskellige etnofarmakologiske indikationer, som f.eks. behandling af gonoré, bronkitis, astma, hudsår, sår, halsbetændelse, livmoderinfektioner, generelle betændelser, kræft og leishmaniaser .

Den videnskabelige litteratur indeholder talrige rapporter om de farmakologiske aktiviteter af Copaifera-arter, såsom deres antiinflammatoriske , antitumoriske , antiproliferative , anthelmintiske , antituberkulære , gastrobeskyttende , kemopræventive , immunmodulerende og antibakterielle virkninger, blandt andre.

Kaurenoinsyre er en diterpen, der forekommer naturligt i nogle brasilianske planter, herunder Copaifera oleoresiner. Der er rapporteret om utallige farmakologiske egenskaber for kaurenonsyre, såsom dens antiinflammatoriske virkning, dens anvendelse til behandling af mavesår og dens antiparasitære, smertestillende og kræftbekæmpende potentiale .

Da naturlige forbindelser traditionelt er blevet anvendt, antages de ofte at være sikre. Mange undersøgelser har imidlertid rapporteret, at flere plantearter, der anvendes i traditionel medicin, udviser mutagene, kræftfremkaldende eller toksiske virkninger . Ikke desto mindre anvendes en række planter og phytoterapeutiske produkter fortsat uden videnskabelig dokumentation for deres sikkerhed.

Ames-testen er verdenskendt for sin evne til at påvise punktmutationer forårsaget af forskellige agenser. Ved denne test anvendes vejledende Salmonella Typhimurium-stammer, som er følsomme over for stoffer, der fremkalder forskellige typer mutationer. På grundlag af Ames-testen er det muligt at fastslå den mutagene virkning af et stof som en funktion af S. Typhimurium-koncentrationen . Denne test anvendes i hele verden til indledende screening af nye lægemidlers mutagene potentiale. Et mutagent respons har en høj prædiktiv værdi for kræftfremkaldende virkning . I årenes løb har det videnskabelige samfund og offentlige myndigheder og virksomheder anerkendt værdien af dette assay.

I betragtning af, at Ames-testen er et fremragende redskab til at vurdere sikkerheden af ekstrakter, olier og fytokemikalier isoleret fra lægeplanter, har vi anvendt denne test til at vurdere det mutagene potentiale af oleoresiner eller bladekstrakter af fire Copaifera-arter og af kaurenonsyre.

2. Materialer og metoder

2.1. Plantemateriale

Plantematerialet blev indsamlet i forskellige brasilianske stater mellem august 2012 og maj 2014. Plantekuponer blev identificeret enten af Dr. Regina Celia Vianna Martins da Silva fra det botaniske laboratorium ved Brazilian Agricultural Research Corporation (Embrapa), Belém, delstaten Pará, Brasilien, eller af Dr. Milton Groppo Junior fra biologiafdelingen ved University of São Paulo, Ribeirão Preto Campus, delstaten São Paulo, Brasilien, hvor kuponerne blev deponeret. Tabel 1 indeholder oplysninger om belægseksemplarerne.

For at trække C. oblongifolia og C. langsdorffii oleoresinerne blev der brugt en snegl til at bore et hul med en diameter på ca. en tomme. Hullet blev boret i midten af træstammen, tre fod over jorden. Oleoresinen blev drænet over i en ravfarvet flaske ved hjælp af et rør, der var forbundet med et filter. Efter opsamling af oleoresinen blev hullet forseglet korrekt.

C. lucens- og C. multijuga-blade blev lufttørret ved 40 °C i 48 timer eller lyofiliseret og pulveriseret i en blender. Det opnåede pulver blev underkastet maceration i ethanol/vand i forholdet 7:3 ved stuetemperatur i 48 timer. Efter filtrering blev opløsningsmidlet inddampet under 40 °C under vakuum. Denne procedure blev gentaget fire gange, og ekstrakterne blev kombineret, koncentreret under vakuum og frysetørret, hvilket gav et gennemsnit på 20 % w/w af rå hydroalkoholiske ekstrakter af bladene.

Kaurenoesyre (figur 1), renhed over 99 %, blev isoleret som beskrevet af Simão et al. Copaifera-arternes oleoresiner og blade blev indsamlet, og forskningen blev udviklet efter tilladelse fra den brasilianske regering gennem SISBIO (Biodiversity Information and Authorization System #35143-1) og CGEN (Genetic Heritage Management Council #010225/2014-5).

Figur 1

Kemisk struktur af kaurenonsyre.

2.2. Ames-test

Ames-testen blev anvendt til at undersøge Copaifera spp. mutagenicitet. Præinkubationsmetoden udviklet af Maron og Ames , med og uden eksogen aktivering (S9), blev anvendt til at analysere forskellige Salmonella Typhimurium-stammer (TA98, TA100, TA97a og TA102) i et forsøg på at identificere agenser, der forårsager genmutationer. Teststammerne, der venligst blev stillet til rådighed af Dr. B.N. Ames (Berkeley, CA, USA), blev dyrket fra frosne kulturer i 12-14 timer natten over i Oxoid Nutrient Broth Number 2.

Til mutagent aktivitetsassayet blev forskellige koncentrationer af hver oleoresin, hvert ekstrakt eller kaurenoesyre opløst i DMSO tilsat 0,1 mL bakteriekultur i 0,5 mL fosfatbuffer 0,2 M eller 0,5 mL 4 % S9-blanding og inkuberet ved 37 °C i 20-30 min. Koncentrationerne varierede fra 62,5 til 500 μg/plade for C. lucens (ekstrakt), fra 120 til 1000 μg/plade for C. multijuga (ekstrakt), fra 125 til 1000 μg/plade for C. oblongifolia (oleoresin), fra 500 til 4000 μg/plade for C. langsdorffii (oleoresin) og fra 25 til 200 μg/plade for kaurenoinsyre. Disse koncentrationer blev valgt på grundlag af en foreløbig toksicitetstest. I alle de efterfølgende analyser var den øvre grænse for det testede dosisinterval enten den højeste ikke-toksiske dosis eller den laveste toksiske dosis, der blev bestemt i den indledende analyse. Toksicitet blev påvist enten som en reduktion i antallet af histidin-revertanter (His+) eller som en udtynding af den auxotrofe baggrundsplæne.

Den metaboliske aktiveringsblanding (S9-fraktion) fremstillet af leveren fra Sprague Dawley-rotter behandlet med den polychlorerede biphenylblanding Aroclor 1254 (500 mg/kg) blev købt fra Molecular Toxicology Inc. (Boone, NC, USA) og blev frisk fremstillet før hver test. Det metaboliske aktiveringssystem bestod af 4 % S9-fraktion, 1 % magnesiumchlorid 0,4 M, 1 % kaliumchlorid 1,65 M, 0,5 % D-glucose-6-fosfat-dinatrium 1 M og 4 % nikotinamid-adenin-dinukleotidphosphat-natriumsalt (NADP) 0.1 M i 50 % fosfatbuffer 0,2 M og 39,5 % sterilt destilleret vand.

Efter inkubation blev der tilsat 2 mL topagar, og blandingen blev hældt på en plade med minimal agar. Pladerne blev inkuberet ved 37 °C i 48 timer, og His+ revertant-kolonierne blev talt manuelt.

Resultaterne blev analyseret med den statistiske softwarepakke Salanal 1.0 (U.S. Environmental Protection Agency, Monitoring Systems Laboratory, Las Vegas, NV, fra Research Triangle Institute, RTP, NC, USA); modellen fra Bernstein et al. blev anvendt. Dataene (revertanter/plade) blev vurderet ved hjælp af variansanalyse (ANOVA), efterfulgt af lineær regression. Det mutagene indeks (MI) blev også beregnet for hver testet koncentration og svarede til det gennemsnitlige antal revertanter pr. testplade divideret med det gennemsnitlige antal revertanter pr. kontrolplade med opløsningsmiddel. En prøve blev betragtet som mutagen, når der blev påvist et dosis-responsforhold, og MI var højere end to (MI > 2) ved en eller flere koncentrationer .

De følgende standardmutagener blev anvendt som positive kontroller i forsøg uden S9-blanding: 4-nitro-O-phenylendiamin (10 μg/plade) for TA98 og TA97a, natriumazid (1,25 μg/plade) for TA100 og mitomycin C (0,5 μg/plade) for TA102. I forsøg med S9-aktivering blev 2-antramin (1,25 μg/plade) anvendt som positiv kontrol for TA98, TA97a og TA100, og 2-aminofluoren (10 μg/plade) blev anvendt som positiv kontrol for TA102. DMSO tjente som opløsningsmiddelkontrol (100 μL/plade), og den negative kontrol svarer til hastigheden af spontan reversion for hver stamme.

3. Resultater

Tabel 2 viser det gennemsnitlige antal revertanter/plade (M), standardafvigelsen (SD) og det mutagene indeks (MI), der blev observeret for S. Typhimurium-stammer TA98, TA100, TA102 og TA97a i tilstedeværelse (+S9) eller i fravær (-S9) af metabolisk aktivering efter prøvebehandling med den pågældende oleoresin, det pågældende ekstrakt eller den pågældende forbindelse.

Vi har hverken C. lucens- og C. multijuga-bladekstrakterne eller C. langsdorffii og C. oblongifolia-oleoresinerne forårsaget genetiske mutationer, som det fremgår af Ames-testen. Kaurenoesyre øgede heller ikke antallet af revertante kolonier, så den udøvede ikke mutagene virkninger ved nogen af de undersøgte koncentrationer eller på nogen af de evaluerede stammer. Opløsningsmiddelkontrollen (DMSO) adskilte sig ikke signifikant af antallet af revertanter fra den negative kontrol.

4. Diskussion

De mutagene virkninger, der udøves af planter, er ikke let mærkbare hos mennesker, og negative langtidsresultater som f.eks. kræft kan manifestere sig. Dermed har den videnskabelige litteratur fremhævet vigtigheden af at screene medicinalplanter for deres mutagene potens . I denne henseende har vi her undersøgt Copaifera spp. og kaurenonsyre mutagene potentiale ved hjælp af Ames-testen. Akyıl og Konuk understregede, at påvisning af genotoksiske stoffer ofte er afhængig af brugen af bakterier som testorganismer. På denne måde er Ames-testen (eller Salmonella/mikrosom-testen) den metode, der oftest anvendes til at påvise genotoksiske agenters mutagene virkninger .

Ames-testens ydeevne ved brug af forskellige stammer er af stor betydning i betragtning af de enkelte stammers særlige karakteristika i forhold til testen. Således skyldes hisG46-markøren i stamme TA100, at et leucin (GAG/CTC) er blevet erstattet af et prolin (GGG/CCC). Denne mutation tilbageføres til wild-typetilstanden ved hjælp af mutagener, der forårsager baseparsubstitutionsmutationer primært ved et af GC-parrene. Den hisD3052-mutation, der bæres af stamme TA98, er en -1 frameshift-mutation, som påvirker læserammen af en nærliggende repetitiv -C-G-C-C-G-C-C-G-C-C-G-G- sekvens. Reversion af hisD3052-mutationen tilbage til wild-typetilstanden induceres af forskellige frameshift-mutagener som f.eks. 2-nitrofluoren og forskellige aromatiske nitrosoderivater af aminkarcinogener. hisD6610-mutationen i stamme TA97a bærer også en +1 frameshift-mutation (cytosin), hvilket resulterer i en serie på 6 cytosiner (-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-). Denne stamme menes at være mere følsom over for nogle af de mutagener, der omdanner stamme TA98. Der blev udviklet stamme TA102, som indeholder AT-basepar på hisG428-mutantstedet. Mutationen bæres på multikopi-plasmidet pAQ1. Plasmidet giver tetracyklinresistens, hvilket er en praktisk markør til at påvise tilstedeværelsen af plasmidet. hisG428-mutationen er en okkermutation, TAA, i hisG-genet, som kan reverseres ved alle seks mulige baseparændringer; både transitioner og transversioner. Denne mutation reverteres også af mutagener, der forårsager oxidativ skade, foruden at påvise tværbindingsmidler .

Dertil kommer, at et biologisk aktivt kemikalie kan biotransformeres til en inaktiv metabolit. På samme måde kan et inaktivt kemikalie biotransformeres til en aktiv metabolit . Det er derfor vigtigt at anvende S9-fraktionen i Ames-testen: den gør det muligt at foretage analyser under tilstedeværelse af metabolisme og giver derved mere pålidelige resultater.

Heri, hvad angår sikkerhed, udøvede i vores resultater hverken kaurenonsyre eller de undersøgte planter (ekstrakter og oleoresiner) mutagene virkninger i de forskellige stammer af Salmonella Typhimurium uanset S9-aktivering.

De fleste artikler om slægten Copaifera rapporterer om oleoresiner, der er fjernet fra træstammen. Det er imidlertid også relevant at studere bladekstrakter, fordi de indeholder lovende bioaktive molekyler. Faktisk kan søgningen efter helbredelse af sygdomme gennem bladinfusion have været en af de første måder at anvende naturprodukter på, en praksis, der stadig anvendes i dag .

Mange Copaifera spp. er populært anvendt som lægeplanter i forskellige lande, fordi disse arter præsenterer mange farmakologiske egenskaber. Hvad angår kaurenonsyre, er der også blevet rapporteret om adskillige biologiske virkninger .

Vores undersøgelse er den første, der undersøger sikkerheden ved C. lucens- og C. oblongifolia-arter, og som også anvender C. langsdorffii i oleoresin til undersøgelse af mutagenicitet. Virkningerne af C. multijuga (oleoresin/ekstrakt) på DNA er blevet undersøgt i tidligere undersøgelser, men ved hjælp af forskellige teknikker i forhold til vores undersøgelse, hvor Ames-testen blev anvendt. Vores resultater bekræfter således data offentliggjort af andre forfattere, som testede andre arter af Copaifera og deres kemiske bestanddele eller anvendte forskellige eksperimentelle modeller og viste, at de ikke skader DNA.

På denne måde kan oleoresin af C. multijuga og dens kemiske markør, diterpen copalsyre, evalueret af Alves et al. ved hjælp af mikronukleusassay (V79-celle) og Ames-test til in vitro-undersøgelse samt mikronukleus- og kometassays (schweiziske mus) til in vivo-test. De opnåede data viste, at ingen af dem udøver nogen genotoksisk/mutagene virkning under de anvendte forsøgsbetingelser. Sammenlignet med vores resultater tyder disse data på, at for C. multijuga påvirker hverken ekstraktet, som blev evalueret i vores undersøgelse, eller oleoresinen, som evalueret af Alves et al. , antallet af revertante kolonier sammenlignet med den negative kontrol i Ames-testen; det samme gælder for copalsyre og kaurenoesyre. Disse resultater tyder på, at mutagenicitet er fraværende, uanset metabolisk aktivering.

I en nyere undersøgelse har Furtado et al. evalueret det genotoksiske potentiale af C. multijuga, og resultaterne viste fravær af DNA-skader, idet behandlingen med både oleoresin og bladekstrakt af C. multijuga ikke øger mikronukleusfrekvensen signifikant in vitro (V79-celle) og in vivo (schweiziske mus). Desuden vurderede forfatterne også ekstrakter og oleoresiner fra andre arter af denne slægt, såsom C. duckei, C. reticulata, C. paupera og C. pubiflora, og ligesom de resultater, der blev fundet for C. multijuga, blev der rapporteret om fravær af genotoksicitet for alle de testede arter.

Resultaterne fra undersøgelser af Alves et al. og Batista et al. viste, at C. langsdorffii ekstrakt ikke signifikant øgede frekvensen af mikronukler (schweiziske mus) i henholdsvis perifert blod og knoglemarv. I en anden undersøgelse viste kometforsøget med Wistar-rotter ikke nogen signifikante forskelle mellem dyr, der kun blev behandlet med C. langsdorffii ekstrakt, og den negative kontrolgruppe . Disse data viser, at ekstraktet ikke udviser genotoksicitet.

For nylig viste in vivo mikronukleustest og kometforsøg med Wistar-rotter, at Copaifera malmei-ekstrakt ikke er genotoksisk og har antimutagen aktivitet. Desuden afslørede den subkroniske toksicitetstest ikke toksikologisk relevante ændringer, som vurderet ud fra adfærdsmæssige, biokemiske og hæmatologiske analyser i op til 30 dage. Disse resultater pegede på Copaifera malmei-ekstraktens høje sikkerhedsmargin til terapeutisk brug . Toxicitets- og genotoksicitetsbestemmelser viste, at brugen af Copaiba olie også er sikker: histopatologisk evaluering afslørede ikke ændringer hos Copaiba oliebehandlede dyr, og mutagenicitetsvurdering (mikronukleustest; 2000 mg/kg legemsvægt) viste ikke genotoksiske virkninger .

Leandro et al. brugte Ames-testen til at vise, at C. trapezifolia-ekstrakt ikke er mutagent over for de samme Salmonella Typhimurium-stammer, som er testet her, uafhængigt af metabolisk aktivering.

Med hensyn til de forskellige Copaifera-arters kemiske sammensætning har UPLC-MS/MS- og CG/MS-analyser af oleoresinerne identificeret sure diterpener og større flygtige sesquiterpener, mens et højt indhold af phenolforbindelser, herunder flavonoide heterosider og galloylquinolsyrederivater, er blevet verificeret i bladene. Blandt oleoresinbestanddelene er diterpener langt de vigtigste komponenter og omfatter ent-agathinsyre, ent-copalsyre og ent-kaurenoesyre, efterfulgt af sesquiterpener som β-bisabolen, α-humulen og trans-β-caryophyllen . I tilfælde af Copaifera-arternes bladhydroalkoholiske ekstrakter indeholder de hovedsageligt quercetin, afzelin og kininsyrer .

I henhold til Almeida et al. , er Copaiba oleoresin (kommercielt produkt) og dets fraktioner, som indeholder sesquiterpener, methylestere af diterpencarboxylsyre og høje β-caryophyllen-niveauer, ikke genotoksiske som påvist ved in vivo kometforsøg eller mikronukleustest. β-caryophyllen, der er hovedbestanddelen af oleoresiner og flygtige fraktioner, fremmer ikke cytotoksiske eller genotoksiske virkninger i humane lymfocytkulturer, og det beskytter mod DNA-skader induceret af ethylmethansulfonat . Evaluering af ni sesquiterpener, herunder trans-caryophyllen, ved Ames-testen har vist, at ingen af forbindelserne er mutagene .

I en nylig undersøgelse viste behandling af mavekræft- og normale maveslimhindecellelinjer med kaurenonsyre, at syrekoncentrationen er stærkt korreleret med DNA-skadeindekset og med mikronukleusfrekvensen, som bestemt ved henholdsvis comet-assay og mikronukleustest . På den anden side har Cavalcanti et al. rapporteret, at lave koncentrationer af kaurenoesyre, et bioaktivt diterpenoid udvundet af C. langsdorffii, heller ikke forårsager DNA-skader eller ændrer mikronukleusfrekvensen i V79-celler. Signifikant øget DNA-skade blev først tydelig efter celleeksponering for højere kaurenoesyrekoncentrationer (30 eller 60 μg/mL).

Her bestemte vi kaurenoesyretoksiciteten for hver evalueret Salmonella Typhimurium-stamme ved at anvende syrekoncentrationer, der starter fra toksicitetsgrænsen. Højere kaurenoesyrekoncentrationer forhindrer bakterievækst, hvilket gjorde det muligt for os at vurdere det mutagene potentiale af denne forbindelse. På grundlag af vores resultater er de her testede oleoresiner ikke mutagene selv ved de højeste undersøgte koncentrationer.

I henhold til litteraturen kan brugen af forskellige organismer eller forskellige testsystemer give forskellige resultater . Dette skyldes, at testsystemer for genotoksicitet og mutagenicitet er opdelt i to grupper. Cytogenetiske metoder analyserer eukaryoter og giver oplysninger, der varierer fra genmutationer til kromosomskader og aneuploidier. I modsætning hertil analyserer bakterielle metoder prokaryoter og giver oplysninger om genmutationer og primære DNA-skader forårsaget af et agens .

Så er test som søster-kromatid-udveksling, kromosomal aberration og mikronukleus blevet anvendt til at påvise DNA-skader på kromosomalt niveau i human biomonitoring, mens Ames Salmonella/mikrosom mutagenicitetsassay er blevet anvendt i vid udstrækning til at verificere den mutagene aktivitet af utallige kemiske stoffer og rå planteekstrakter .

I henhold til Ferguson kan stoffer være klastogene i pattedyrceller, hvilket er tilfældet med de stoffer, der anvendes i mikronukleustesten. De samme stoffer kan imidlertid være negative i bakterieforsøg som f.eks. Ames-testen. Det er derfor vigtigt at vurdere sikkerheden ved planter eller deres kemiske forbindelser ved at fokusere på evaluering af de forskellige former for genetiske skader. Det anbefales at kombinere Ames-testen med in vitro-undersøgelser af pattedyrsceller, fordi de kan dække flere væsentlige mutagene parametre (genetiske mutationer, strukturelle kromosomskader og aneuploidi) og også dækker testene i prokaryote og eukaryote systemer. Desuden fremhæver litteraturen også, at undersøgelsen ved Ames-testen ikke bør udelades, fordi bakteriegenmutationstesten påviser alle relevante virkningsmåder, der specifikt fører til genmutationer .

I tidligere arbejde er det konstateret, at stoffer udelukkende kan være positive i en eller flere af pattedyrcellelinjerne, dvs. at de positive resultater ikke understøttes af Ames-testen eller in vivo-testene . Faktisk er de resultater, der først opnås ved Ames-testen, efterfølgende reproduceret i forsøg med dyr ; derfor har fraværet af mutagenicitet i Ames-testen gjort det muligt at fremstille nye lægemidler med færre bivirkninger . Disse data understreger betydningen af undersøgelser som vores, der påviser fraværet af mutagenicitet af planter og deres vigtigste bestanddele ved hjælp af Ames-testen.

5. Konklusioner

Overordnet set støtter vores resultater den sikre anvendelse af de udvalgte lægeplanter, der tilhører slægten Copaifera. Ikke desto mindre kan de mutagene virkninger af enkelte forbindelser være maskeret på grund af antagonistiske virkninger af andre forbindelser i ekstrakterne eller oleoresinerne . Vores resultater viser således også, at både kaurenonsyre og de evaluerede lægeplanter kan betragtes som potentielt sikre til terapeutisk brug.

Databesiddelse

Den data, der er anvendt til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, er inkluderet i artiklen.

Oplysning

Carlos Henrique Gomes Martins, Flávia Aparecida Resende og Jaqueline Lopes Damasceno havde fuld adgang til alle data i undersøgelsen og påtager sig ansvaret for dataintegriteten og nøjagtigheden af dataanalysen.

Interessekonflikter

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Autors bidrag

Yadira Fernández Arnet, Giovanna Capaldi Fortunato, Luiza Girotto, Gabriel Davi Marena, Beatriz Patti Rocha, Flávia Aparecida Resende, Sergio Ricardo Ambrosio, Rodrigo Cássio Sola Veneziani og Jairo Kenupp Bastos har ydet væsentlige bidrag til udformning og design, indsamling, analyse og fortolkning af data. Jaqueline Lopes Damasceno, Flávia Aparecida Resende og Carlos Henrique Gomes Martins har været involveret i udarbejdelsen af manuskriptet eller har været med til at revidere det kritisk for at sikre et vigtigt intellektuelt indhold. Carlos Henrique Gomes Martins og Flávia Aparecida Resende indvilligede i at stå til ansvar for alle aspekter af arbejdet. Alle forfattere har læst og godkendt det endelige manuskript.

Anerkendelser

Forfatterne takker CAPES (koordinering til forbedring af personale i videregående uddannelser), CNPq (det nationale råd for videnskabelig og teknologisk udvikling) og São Paulos forskningsfond (FAPESP, tilskud nr. 2011/13630-7 og 2012/25237-0) for finansiel støtte og universitetet Franca for den modtagne støtte. Jaqueline Lopes Damasceno har modtaget et ph.d.-stipendium fra CAPES (Coordination for the Improvement of Higher Level-or Education-Personnel).