γδ-selektion

γδT celler opstår fra DN thymocytter, da omarrangeringen af TCRγ og δ kæderne sker i DN stadier . γδ-prækursorceller, som har TCRγ og δ omarrangeret før TCRβ-rekombination, udtrykker γδTCR/CD3-komplekset på plasmamembranen, hvor γδTCR selvoligomeriseres ligesom pre-TCR’en og initierer intracellulære signalveje . Dette γδTCR-signal inducerer den proces, der kaldes “γδ-selektion”, som bekræfter dannelsen af funktionelle TCRγδ-kæder, hvilket får cellen til at erkende, at “jeg er en γδT-celle” .

Det γδ-selektionssignal udløser differentieringen fra CD5- CD24høje γδ-prækursorceller til CD5+ CD24lave γδT-engagerede celler med CD5+ CD24lavt indhold . Overgangen fra CD5- til CD5+ γδT-celler er markant forringet hos Syk-deficiente mus, mens Zap70-deficiente mus udviser normal differentiering af CD5+ γδT-celler. Zap70/Syk-dobbelt defekte mus udviser et fuldstændigt stop for differentieringen af γδT-cellerne i CD5-prækursorstadiet . γδ-selektion er således hovedsagelig afhængig af det Syk-medierede signal, og Zap70 spiller kun en mindre og overflødig rolle i denne proces. Denne mekanisme er ganske analog med den for β-selektion. Et kritisk mål for Syk i γδ-selektionssignalet er Lat-signalosomet, da Lat-deficiente mus udviser fuldstændig hæmning af γδ-selektion og en total mangel på modne γδT-celler .

γδ-prækursorceller fra Syk/Zap70-deficiente mus eller Lat-deficiente mus kan ikke skelnes fra αβT-linjeceller ved udtrykket af deres celleoverfladeproteiner bortset fra γδTCR, og de bevarer stadig potentialet til at differentiere sig til αβT-celler. Hvad bestemmer differentieringsskæbnen til αβT- eller γδT-linjen fra forløberen? Dette spørgsmål er blevet besvaret ved hjælp af undersøgelser med γδTCR-transgene mus. Når γδTCR-signalet svækkes ved mangel på enten signalproteiner eller endogene ligander for det transgene γδTCR-signal, giver forstadiecellerne anledning til DP-celler af αβT-linjen på bekostning af γδT-linjerne . Disse resultater tyder på, at et stærkere signal (sandsynligvis ved γδTCR-ligandinteraktion) fører til forpligtelsen til γδT-celler, mens et svagere signal (sandsynligvis ved ligand-uafhængig præ-TCR) fører til αβT-differentiering. Eksperimenter med en anden transgen musestamme, der udtrykker γδTCR med samme ligandspecificitet, viste imidlertid, at γδT-celler var i stand til at modnes i fravær af liganderne . Chien og medarbejdere anvendte en tetramerisk farvningsmetode til at identificere den ligandspecifikke γδT-cellepopulation med henblik på at undersøge betydningen af endogene γδTCR-ligander i ikke-transgene mus. Resultaterne viste tydeligt, at antallet af ligand-specifikke γδT-celler var sammenligneligt mellem ligand-sufficiente og -deficiente mus, hvilket tyder på, at størstedelen af γδT-cellerne ikke er stødt på ligander under thymusdifferentieringen . Forfatterne fremlagde også beviser for, at nogle γδTCR’er kan signalere liganduafhængigt . Disse observationer er tydeligvis i modstrid med den tidligere model om, at γδT-lineage commitment kræver γδTCR-ligandinteraktion. Da polyklonale γδT-celler, der reagerer på visse eksogene ligander, differentierer og modnes funktionelt i thymus, er det sandsynligt, at observationerne i visse γδTCR-transgene muselinjer ikke afspejler flertallet af γδT-celler med polyklonale γδTCR’er.

For at undersøge virkningen af γδ-selektionssignalet på αβT/γδT-differentieringen anvendte vi Lat-deficiente mus, idet γδT-celledifferentieringen er standset på CD5-prækursorstadiet. γδTCR+-prækursorceller blev oprenset fra voksne Lat-deficiente mus, inficeret med retrovirus, der udtrykker Lat, og dyrket på stromale cellemonolag (Fig. 2a). Dette eksperiment gør det muligt at foretage en direkte evaluering af cellefænotypen før og efter γδ-selektion under ligandfrie forhold. Sammenlignet med ikke-transducerede kontrolceller udviste Lat-udtrykkende γδT-celler en markant induktion af overfladeekspressionen af CD5 (Fig. 2b) samt mRNA-ekspression af γδT-celle-signaturgener (Tcrd, Egr3, Runx3 og Bcl-2) og fuldstændig ophævelse af transkription af gener, der er forbundet med forstadier til DN-celler og αβT-celler (Rag1, Rag2 og Ptcra) (Fig. 2c). Disse resultater tyder på, at γδTCR-signalet både driver differentiering mod γδT-linjen og undertrykker differentiering til αβT-linjen på en ligand-uafhængig måde.

Og selv om de mekanismer, hvormed præ-TCR og γδTCR styrer differentieringsprocesserne til henholdsvis αβT- og γδT-linjerne, stadig er uklare (og omdiskuterede), er det samlet set sandsynligt, at γδ-selektion, i det mindste i størstedelen af de naturligt genererede γδT-celler, ikke er betinget af kognat γδTCR-ligand i thymus.

γδTCR-signalstyrke bestemmer γδT17/γδT1-differentiering

Under udviklingen af både αβT- og γδT-linjeagene er ekspressionen af Syk og Zap70 omvendt reguleret: Syk udtrykkes i høj grad i de tidlige stadier (DN1-3 og γδ-prækursor) og nedreguleres derefter, mens Zap70 udtrykkes i de senere stadier (efter β-selektion eller γδ-selektion) . γδT-celler, der har gennemgået γδ-selektion, udtrykker høje niveauer af Zap70 samt γδTCR/CD3-komplekser og kan reagere på endogene ligander, hvis de er tilvejebragt i thymus. Det er i øjeblikket anerkendt, at γδT-celler i modsætning til αβT-celler ikke gennemgår ligand-drevet positiv selektion eller klonaldeletion i thymus. Flere undersøgelser har antydet, at γδTCR-ligandinteraktionen i thymus i stedet styrer γδT-cellernes effektorfunktion.

Ved hjælp af tetramerisk farvning af en γδT-cellepopulation, der er reaktiv over for de ikke-klassiske MHC-klasse I-molekyler T10 og T22, fandt Chiens gruppe, at antigen-naive γδT-celler, der udviklede sig i fravær af liganderne, fortrinsvis producerede IL-17, mens antigen-erfarne γδT-celler, der udviklede sig i tilstedeværelse af liganderne, fortrinsvis producerede IFNγ . Denne undersøgelse antydede for første gang den idé, at et ligandinduceret stærkt γδTCR-signal og et svagt γδTCR-signal inducerer henholdsvis γδT1- og γδT17-celler. En nylig undersøgelse med nyligt genererede T10/T22-deficiente mus rapporterede stort set de samme resultater, hvilket understøtter denne “signalstyrke-model” . Denne model er blevet yderligere understøttet af andre undersøgelser. Den thymiske modning og effektordifferentiering af Vγ5Vδ1 γδT-celler kræver Skint1 (og sandsynligvis andre proteiner fra Skint-familien), et formodet kostimulerende protein for Vγ5Vδ1 TCR . I fravær af Skint1 er Vγ5Vδ1 γδT-celler fejlorienteret til en γδΤ17-cellefænotype på bekostning af γδΤ1-cellefænotypen . Endvidere kræver γδT1-celleudvikling også kostimulering via CD27, et protein fra TNF-receptorsuperfamilien, der udtrykkes i γδT1-celler, men ikke i γδT17-celler . For nylig har Penningtons gruppe identificeret thymiske bipotente γδT-celler (CD24lo CD44lo CD44lo CD45RBlo), som kan give anledning til både γδT17-celler og γδT1-celler. I fosterthymusorgankultur blev udviklingen af γδT17-celler hæmmet af stærke TCR-signaler induceret ved stimulering med anti-TCRδ- eller anti-CD3ε-antistoffer, men disse virkninger blev ophævet ved farmakologisk hæmning af MEK/ERK-vejen . Disse data giver direkte beviser for, at γδTCR-signalstyrken er en kritisk determinant for γδT-celleeffektorfunktionen.

På transkriptionelt niveau inducerer det stærke γδTCR-signal ekspression af γδT1-associerede transkriptionelle regulatorer, såsom Egr2, Egr3 og Id3, hvilket resulterer i en γδT1-celle skæbne . Id3 hæmmer vedtagelsen af γδT17-celle skæbne ved at hæmme den transkriptionelle regulering, der formidles af HEB (kodet af Tcf12) . HEB kan binde direkte opstrøms for de transkriptionelle startsteder for Sox4 og Sox13 for at fremme deres ekspression. Disse γδT17-associerede transkriptionelle faktorer er nødvendige for ekspression af den essentielle transkriptionelle faktor RORγt (kodet af Rorc) og signalproteinet Blk . I betragtning af disse kendsgerninger viser modellen for TCR-signalstyrke klart de mekanismer, hvormed TCR-signalet styrer γδT-cellernes effektorfunktion.

En række undersøgelser har imidlertid vist virkningen af genetisk ablation af TCR-signalmolekyler på γδT-cellernes effektorfunktion, hvilket udfordrer ideen om, at γδTCR-signalstyrken alene bestemmer γδT17/γδT1-differentieringsskæbnen. Zap70 W163C-mutante mus udviser et fuldstændigt tab af Vγ6+ γδT17-celleudvikling, men har normal udvikling af γδT1-celler, mens TCR-signalerne er dæmpet hos disse mus . En anden undersøgelse af Silva-Santos og medarbejdere viste, at mus haploinsufficiente for CD3δ og CD3γ (CD3DH), som havde lavere celleoverfladeekspression af γδTCR/CD3-komplekserne og nedsat γδTCR-signalering , udviste en markant reduktion af den thymiske udvikling af Vγ6+ γδT17-celler samt γδT1-celler, men ikke af Vγ4+ γδT17-celler, hvilket tyder på, at γδT17-undergrupperne kræver forskellig γδTCR-signalstyrke for deres udvikling . Selv om αβT-celleudvikling og αβTCR-signaltransduktion ikke var påvirket i CD3DH-mus, er denne musestamme den eneste dyremodel indtil videre, hvor der er påvist specifik hæmning af γδTCR-signalering. Det er fortsat uklart, hvorfor γδT-celler er specifikt påvirket i CD3DH-mus, men det er sandsynligt, at den særlige sammensætning af TCR-CD3-komplekserne αβT- og γδT-cellerne er årsag til den unikke fænotype hos CD3DH-mus. I denne forbindelse skal det bemærkes, at mus med CD3ε C80G-mutationen, som ikke er i stand til at inducere konformationsændringer i TCR, også udviser nedsat γδT17-celleudvikling, men normal γδT1-celleudvikling .

Syk er nødvendig for γδT17-differentiering

For nylig rapporterede vi om en ny reguleringsmekanisme, hvorved de γδTCR-proximale kinaser Syk og Zap70 differentielt kontrollerer γδT17-induktion . Syk-deficiente mus udviser fuldstændigt tab af γδT17-celler (både Vγ4+- og Vγ6+-undergrupper) i thymus. Især tvungen ekspression af Zap70 i Syk-deficiente T-progenitorceller formåede ikke at genoprette γδT17-cellegenerationen, hvilket tyder på en ikke-redundant rolle for Syk i γδT17-differentiering. Da Syk-, men ikke Zap70-deficiente γδT-celler udviser en betydelig reduktion af Akt-fosforylering induceret af γδTCR-stimulering, tyder det på, at Syk medierer den γδTCR-inducerede aktivering af PI3K-Akt-vejen. PI3K-deficiente mus (p110γ-/- p110δ-/-) udviser fuldstændig hæmning af γδT17-celleudviklingen, men er upåvirket med hensyn til γδ-selektion (CD5-opregulering) eller γδT1-udvikling. Hæmning af PI3K viste sig at reducere ekspressionen af γδT17-associerede transkriptionsfaktorer (Rorc, Sox13 og Sox4), hvilket tyder på, at PI3K-Akt-vejen spiller en afgørende rolle ved induktion af γδT17-differentieringsprogrammet. I overensstemmelse hermed har en tidligere rapport vist, at kinaseinaktive PI3Kδ eller PI3Kγ-deficiente mus udviser en markant reduktion i det perifere γδT17-celleantal og en forbedring af γδT17-afhængig inflammation . PI3K-Akt-vejen er også nødvendig for differentiering af IL-17-producerende αβT (Th17)-celler , hvilket tyder på, at denne signalvej er en fælles reguleringsmekanisme, der deles af αβT- og γδT-linjerne til induktion af IL-17-producerende proinflammatoriske undergrupper.

γδTCR-induceret aktivering af PI3K-Akt-signalvejen afhænger af Syk, men ikke af Lat, hvilket indikerer, at Syk driver PI3K-Akt-signalvejen til induktion af γδT17-differentiering ud over den Lat-afhængige mainstream-signalvej, der inducerer γδ-selektion . Det er uklart, om Syk aktiverer PI3K/Akt-vejen i γδT-celler gennem direkte interaktion eller på en indirekte måde. En tidligere undersøgelse rapporterede, at Rasgrp1-deficiente mus viser en γδT-celleeffektorfænotype svarende til PI3K-deficiente mus (dvs. et tab af γδT17-celler og en forøgelse af γδT1-celler) . Da Rasgrp1 kan fungere som en opstrømsaktivator af PI3K/Akt-vejen i αβTCR-signalering , er det sandsynligt, at Rasgrp1 videresender signaler fra γδTCR til PI3K for at inducere γδT17-differentiering.

Præferentielt tab af γδT17-celler blev også rapporteret hos mus med mangel på Blk, en Src-familiekinase, der udtrykkes i γδT-celler såvel som B-celler, selv om dens funktion i γδTCR-signaltransduktion er ukendt .

Zap70 kontrollerer visse γδT-celleundergrupper

Vi har også påvist Zap70’s rolle i den thymiske differentiering af γδT-celler . Zap70-deficiente mus udviser en markant reduktion af Vγ6+ celler, hvoraf størstedelen er γδT17, men er upåvirkede med hensyn til udviklingen af andre γδT-celler, herunder Vγ1+ såvel som Vγ4+ undergrupper. Faktisk var ekspressionsniveauet af Zap70-proteinet højest i Vγ6+-undergruppen blandt γδT-cellerne. Da CD5-ekspressionen var lavere i de Zap70-deficiente Vγ6+-celler end i kontrolcellerne, er Zap70 sandsynligvis påkrævet for thymisk modning af Vγ6+-celler. I vores forsøg havde Zap70-deficiente mus normal thymisk differentiering af Vγ4+ celler, herunder γδT17-subgruppen, hvilket modsiger den tidligere rapport, hvor en hypomorphisk Zap70-mutation forårsagede en reduktion af thymiske Vγ4+ γδT17-celler . Denne uoverensstemmelse kan skyldes de forskellige mus, der blev anvendt i de to undersøgelser (Haydays gruppe anvendte hypomorfe Zap70-mutante mus på en BALB/c-baggrund, mens vi anvendte fuldstændigt Zap70-deficiente mus på en C57BL/6-baggrund). Desuden udviste Zap70-deficiente mus en betydelig reduktion af perifere Vγ4+ celler, som omfattede både γδT17- og γδT1-undergrupper, men havde ubeskadigede Vγ1+ celler. I modsætning til Zap70’s væsentlige rolle i αβT-celleudviklingen er kravet til Zap70 således begrænset til den thymiske modning af Vγ6+-celler og den perifere vedligeholdelse af Vγ4+-celler.

Vores resultater vedrørende Zap70’s og Syk’s forskellige roller kan give et nyt fingerpeg til at forstå mekanismerne i γδTCR-signalering og γδT-celleudvikling. Zap70 er påkrævet for αβTCR-signalering og γδTCR-signalering i visse γδT-celleundergrupper. I αβT-celler er aktiveringen af Zap70 afhængig af Lck, som er koblet med CD4- eller CD8-coreceptorer, der binder til pMHC på overfladen af antigenpræsenterende celler . Det antydes således, at Lck-Zap70 er en signalakse, der er specialiseret i antigengengenkendelse opnået ved celle-cellekontakt; selv om det i tilfælde af γδT-celler fortsat er uklart, hvordan Zap70 aktiveres på trods af manglende CD4- og CD8-ekspression. I modsætning hertil er Syk associeret med en lang række immunreceptorer, herunder pre-TCR, γδTCR, BCR og FcR . Da Syk er i stand til at fosforylering af ITAM’er og downstream-mål uafhængigt af Src-familiens kinaser som Lck , kan disse receptorer aktiveres ligand-uafhængigt eller ved binding til en række forskellige opløselige antigener såvel som antigener på celleoverfladen. Anvendelsen af Syk eller Zap70 i immunreceptorsignalering kan således diktere, hvordan receptoren genkender antigenet. Faktisk gjorde ekspression af Syk i stedet for Zap70 αβT-celler i stand til at reagere på opløselig anti-CD3-antistofstimulering, mens normale αβT-celler kun reagerede på multimeriserede anti-CD3-antistoffer, der efterligner interaktionen med pMHC på celleoverfladen . Disse resultater fik os til at opstille den hypotese, at lymfocytternes antigengengenkendelse måske ikke kun bestemmes af deres receptor i sig selv, men også af forskellig brug af kinaser fra Syk-familien. På grundlag af dette koncept forudsiger vi, at der findes endogene γδTCR-ligander på celleoverfladen, som er nødvendige for thymisk modning af Vγ6+-celler samt for den perifere vedligeholdelse af Vγ4+-celler, og at Vγ1+-celler ikke kræver γδTCR-ligander på celleoverfladen for deres udvikling og/eller vedligeholdelse.

γδTCR-uafhængige og -afhængige processer for γδT17-induktion

En nyere rapport viste på elegant vis, at γδT17-celler opstår fra en progenitor, der er forskellig fra de andre γδT-celleundergrupper . Det blev rapporteret, at foster-originale, intrathymiske progenitors, der udtrykker høje niveauer af Sox13, blev identificeret i en population, der tidligere var kategoriseret som DN1d (CD44+CD25-c-kit-CD24hi) thymocytter. Disse Sox13+ progenitorer gav fortrinsvis anledning til γδT17-celler i den rekonstruerede føtale thymus, mens andre progenitorer inden for DN2-populationen ikke gjorde det. Det vigtigste er, at Sox13+-progenitorerne kunne påvises, og at deres γδT17-linjeprogrammer var intakte i TCRδ-deficiente eller Rag-deficiente mus, hvilket indikerer, at γδT17-linjen skæbne er “forudindrettet” ved en celleintrinsisk, γδTCR-uafhængig mekanisme. En tidligere rapport viste imidlertid, at γδT17-celler kan udvikle sig fra DN2-stadiet (CD44+CD25+c-kithi), når de samkultiveres på et monolag af Notch-ligand-udtrykkende stromale celler . Der kan således være behov for at redefinere differentieringsstadierne og progenitor-descendent-forholdet i γδT-celleudviklingen.

Figur 3 opsummerer differentieringsprocesserne for γδT-celler såvel som αβT-celler og fremhæver forskellene i kravet om αβ/γδTCR-signaler og Syk-familiekinaser. De tidlige differentieringstrin, dvs. β-selektion til αβT-cellelinjen og γδ-selektion til γδT-cellelinjen, er drevet af ligand-uafhængig pre-TCR- eller γδTCR-signalering, der tjener som et kontrolpunkt for de celler, der udtrykker henholdsvis en funktionel TCRβ-kæde eller γδTCR-kæde. Disse ligand-uafhængige receptorsignaler initieres af Syk, som udtrykkes i DN-thymocytter, herunder γδT-prækursorer. I γδT-cellelinjen er det Syk-medierede γδTCR-signal også påkrævet for priming af γδT17-celledifferentiering via aktivering af PI3K-vejen. Under både β-selektion og γδ-selektion er ekspressionen af Syk og Zap70 omvendt reguleret: Syk nedreguleres, mens Zap70 opreguleres ved præ-TCR- eller γδTCR-signalering. Derfor afhænger det senere trin i αβT-linjedifferentieringen af Zap70-medieret αβTCR-signalering, som gør det muligt for DP-thymocytter at genkende pMHC på overfladen af TEC’er for at blive positivt eller negativt selekteret alt efter styrken af αβTCR-pMHC-interaktionen. I modsætning hertil bestemmer Zap70-medieret γδTCR-signalering som reaktion på endogene ligander γδT-cellernes effektorfunktion: et stærkt signal inducerer γδT1, mens et svagt/ingen signal inducerer γδT17.