Røntgenstråleres vekselvirkning med elektronerne i en krystal giver anledning til et diffraktionsmønster, som matematisk set er Fourier-transformationen af elektrontæthedsfordelingen. De detektorer, der anvendes til at måle røntgenstrålerne, kan imidlertid kun måle amplituden af de diffrakterede røntgenstråler; de faseforskydninger, der er nødvendige for at anvende Fouriertransformationen og finde elektrontæthedsfordelingen, kan ikke måles direkte ved hjælp af denne metode. Dette er i fysikverdenen kendt som “faseproblemet”. Forenklet sagt kan faserne ikke findes ud fra de målte amplituder af røntgenstrålerne. Der skal foretages andre ekstrapolationer og yderligere eksperimenter for at få et kort over elektrontætheden. Mange gange kan de eksisterende data om forbindelsens fysiske og kemiske egenskaber være til hjælp, når der er tale om et dårligt tæthedskort. En anden metode, kendt som Patterson-syntese, er meget nyttig til at finde frem til et indledende skøn over faserne, og den er meget nyttig i de indledende faser til bestemmelse af proteiners struktur, når faserne ikke er kendt. Problemet kan forenkles ved at finde et atom, som regel et tungmetal, ved hjælp af Patterson-syntese og derefter bruge dette atoms position til at estimere de indledende faser og beregne et indledende elektronetæthedskort, som yderligere kan hjælpe med at modellere andre atomers position og forbedre faseskønnet endnu mere. En anden metode kaldes Molecular Replacement; den lokaliserer proteinstrukturens placering i cellen. Ud over den molekylære erstatningsmetode kan faseproblemet også løses ved den isomorfe erstatningsmetode, den anomale diffraktionsmetode med flere bølgelængder, den anomale diffraktionsmetode med en enkelt bølgelængde og direkte metoder.

Molekylær erstatningRediger

Faseproblemet kan løses ved at have en atomar model, der kan beregne faser. En model kan fås, hvis den beslægtede proteinstruktur er kendt. For at opbygge denne atomare model skal modellens orientering og position i den nye enhedscelle imidlertid bestemmes. Det er her teknikken, molekylær udskiftning (eller MR) kommer ind i billedet.

Molekylær udskiftning, også kendt som MR, er en metode til at løse faseproblemer i røntgenkrystallografi. MR lokaliserer orienteringen og positionen af en proteinstruktur med dens enhedscelle, hvis proteinstruktur er homolog med den ukendte proteinstruktur, der skal bestemmes. De opnåede faser kan bidrage til at generere elektrontæthedskort og bidrage til at producere beregnede intensiteter af proteinstrukturmodellens position i forhold til de observerede strukturer fra røntgenkrystallografiforsøget.

MR-metoden er også effektiv til løsning af makromolekylære krystalstrukturer. Denne metode kræver mindre tid og indsats til strukturbestemmelse, da tunge atomderivater og indsamling af data ikke behøver at blive forberedt. Metoden er ligetil, og modelopbygningen er forenklet, fordi den ikke kræver nogen kædesporing.

Denne metode består af to trin:

1. en rotationssøgning for at orientere den homologe model i enhedscellen eller målet
2. en translationssøgning, hvor den nye orienterede model placeres i enhedscellen

Patterson-baseret (Molecular Replacement)Edit

Patterson-kort er interatomare vektorkort, der indeholder peaks for hvert beslægtet atom i enhedscellen. Hvis Pattersonkortene blev genereret på grundlag af de data, der er afledt af elektronetæthedskortene, bør de to Pattersonkort kun være nært beslægtede med hinanden, hvis modellen er korrekt orienteret og placeret i den korrekte position. Dette vil give os mulighed for at udlede oplysninger om placeringen af den ukendte proteinstruktur med dens celle. Der er imidlertid et problem med molekylær erstatning, den har seks dimensioner, tre parametre til at angive orientering og position. Med Patterson maps kan den opdeles i delmængder af parametrene for at se på hver del separat.

RotationsfunktionRediger

Rotationsfunktionen har intramolekylære vektorer, der kun afhænger af molekylets orientering og ikke dets position, fordi selv når molekylet er translateret i enhedscellen, er alle atomer forskudt med samme mængde, men vektorerne mellem atomerne er de samme. Patterson-kortet for den ukendte proteinstruktur sammenlignes med den homologe kendte proteinstruktur i forskellige orienteringer

Klassisk rotationsfunktionRediger

For at finde orienteringen skal du bestemme rotationsaksen og rotationsvinklen omkring denne akse. Der skal to parametre til for at definere en akse (en vektor fra kuglens centrum til et punkt på kuglens overflade). Rotationsaksen starter parallelt med z-aksen og roteres rundt om y-aksen med vinklen ᶱ, derefter roterer objektet rundt om z-aksen med vinklen ᶲ, og til sidst roterer det rundt om rotationsaksen med vinklen ᵠ. Disse angiver et punkt på overfladen af en enhedssfære.

Hurtig rotationsfunktionRediger

Rotationsfunktionen kan beregnes ved at sammenligne to Patterson-kort eller toppene i disse Patterson-kort. Rotationsfunktionen kan kun beregnes meget hurtigere med Fouriertransformationer, hvis Pattersons blev udtrykt i sfæriske harmoniske harmoniske.

Direkte rotationsfunktionRediger

I den direkte rotationsfunktion kan proteinstrukturen placeres i enhedscellen for den ukendte struktur, og Patterson for det orienterede molekyle sammenlignes med Patterson for hele den ukendte strukturs Patterson.

Translation FunctionEdit

Når orienteringen af den kendte struktur er kendt, kan dens model (elektrontæthedskort) orienteres for at beregne strukturfaktorer, hvor en korrelationsfunktion anvendes til at bestemme vektoren til at oversætte modellen oven på den homologe model inden for en asymmetrisk enhed.

Med de korrekte orienterede og oversatte fasemodeller af proteinstrukturen er det nøjagtigt nok til at udlede elektrontæthedskort fra de afledte faser. Elektronetæthedskortene kan bruges til at opbygge og forfine modellen af den ukendte struktur.

Anomal diffraktion i flere bølgelængderRediger

X-stråler genereres i store maskiner kaldet synkrotroner. Synchotroner accelererer elektroner til næsten lysets hastighed og sender dem gennem en stor, hul metalpolygonring af metal. I hvert hjørne bøjer magneter elektronstrømmen, hvilket forårsager afgivelse af energi i form af elektromagnetisk stråling. Da elektronerne bevæger sig med lysets hastighed, udsender de røntgenstråler med høj energi.

Fordelene ved at bruge synkrotroner er, at forskerne ikke behøver at dyrke flere versioner af hvert enkelt krystalliseret molekyle, men i stedet kun dyrke én type krystal, der indeholder selen. De har derefter mulighed for at indstille bølgelængden, så den passer til selenets kemiske egenskaber. Denne teknik er kendt som Multiwavelength Anomalous Diffraction (anomal diffraktion i flere bølgelængder). Krystallerne bombarderes derefter flere gange med bølgelængder af forskellig længde, og til sidst opstår der et diffraktionsmønster, som gør det muligt for forskerne at bestemme selenatomerens placering. Denne position kan bruges som en reference eller markør til at bestemme resten af strukturen. Fordelene ved dette giver forskerne mulighed for at indsamle deres data meget hurtigere.

Isomorphous Replacement MethodEdit

Denne metode sammenligner røntgendiffraktionsmønstrene mellem den oprindelige proteinkrystal og den samme type krystal med en tilføjelse af mindst ét atom med højt atomnummer. Metoden blev anvendt til at bestemme strukturen af små molekyler og til sidst af hæmoglobin af Max Ferdinand Perutz (1914-2002). Der er tale om en perfekt isomorfi, når den oprindelige krystal og dens derivat har nøjagtig den samme konformation af proteinet, molekylernes position og orientering samt enhedscelleparametrene. Den eneste forskel, som krystallen og dens derivat har i en perfekt isomorfi, er intensitetsforskellene som følge af tilføjelsen af tunge atomer på derivatet. Disse forskelle kan identificeres manuelt eller ved hjælp af en automatisk Patterson-søgningsprocedure, såsom SIR 2002, SHELXD, nB og ACORN, og sådanne oplysninger er vigtige for at bestemme proteinets fasevinkler. Perfekt isomorfi forekommer dog næppe på grund af ændringen i celledimensionerne. For proteinet med tunge atomer er den tolerable ændring i celledimensionen dmin/4, idet dmin er opløsningsgrænsen. Andre faktorer, såsom rotation, bidrager også til nonisomorfi.

ProcedurerRediger

1. Opret et par derivater af proteinet i krystallinsk struktur. Mål derefter celledimensionen for at kontrollere for isomorfi.
2. Saml røntgenintensitetsdata for det oprindelige protein og dets derivat.
3. Anvend Patterson-funktionen for at bestemme koordinaterne for det tunge atom.
4. Forfine parametrene for det tunge atom og beregne proteinets fasevinkel.
5. Beregn proteinets elektrontæthed.

Derivaterne er lavet ved hjælp af to forskellige metoder. Den foretrukne metode er at lægge proteinkrystallen i blød i en opløsning, der er sammensat identisk med moderluddet, men med en lille forøgelse af udfældningskoncentrationen. En anden metode er samkrystallisation, men den er ikke almindeligt anvendt, fordi krystallen ikke vil vokse eller vokse nonisomorft. Indblødningsproceduren afhænger af, hvor brede krystalporerne er. Porerne skal være brede nok til, at reagenset kan diffundere ind i krystallen og nå de reaktive steder på overfladen af alle proteinmolekyler i krystallen.

Multiple Wavelength Anomalous Diffraction MethodEdit

Multiple Wavelength Anomalous Diffraction (forkortet MAD) er en metode, der anvendes i røntgenkrystallografi, og som gør det muligt at bestemme strukturerne af biologiske makromolekyler, såsom proteiner og DNA, for at løse faseproblemet. Kravene til strukturen omfatter atomer, der forårsager betydelig spredning fra røntgenstråler; navnlig svovl- eller metalioner fra metalloproteiner. Da selen kan erstatte naturligt svovl, er det mere almindeligt anvendt. Brugen af denne teknik letter i høj grad krystallografen fra at bruge MIR-metoden (Multiple Isomorphous Replacement), da præparation af tunge forbindelser er overflødig.

Denne metode bruges til at løse faseproblemer, når der ikke er tilgængelige data vedrørende spredt diffraktion ud over amplituder. Desuden anvendes den, når et tungmetalatom allerede er bundet inde i proteinet, eller når proteinkrystallerne ikke er isomorfe, hvilket er uegnet til MIR-metoden. Metoden er for det meste blevet anvendt til tungmetalopløsning, disse metalenzymer kommer normalt fra 1. overgangsserie og deres naboer. Det er vigtigt at have en kilde til et kraftigt magnetfelt for at kunne udføre dette eksperiment, og miljøer som f.eks. underjordiske bør overvejes. En partikelaccelerator kaldet en synkrotron er også nødvendig for metoden.

Single-Wavelength Anomalous Diffraction MethodEdit

I sammenligning med anomal diffraktion med flere bølgelængder (MAD) bruger anomal diffraktion med en enkelt bølgelængde (SAD) et enkelt sæt data fra en enkelt bølgelængde. Den vigtigste fordelagtige forskel mellem MAD og SAD er, at krystallen tilbringer mindre tid i røntgenstrålen ved SAD, hvilket reducerer den potentielle strålingsskade på molekylet. Da SAD kun anvender én bølgelængde, er det også mere tidseffektivt end MAD.

Elektrontæthedskort, der er afledt af anomale diffraktionsdata fra enkeltbølgelængder, skal undergå ændringer for at løse fasetvetydigheder. En almindelig modifikationsteknik er opløsningsmiddeludjævning, og når SAD kombineres med opløsningsmiddeludjævning, er de elektrontæthedskort, der fremkommer, af sammenlignelig kvalitet med dem, der er afledt af fuld MAD-fasering. Opløsningsmiddeludjævning indebærer justering af elektrontætheden i de interstitielle områder mellem proteinmolekyler, der er besat af opløsningsmidlet. Det antages, at opløsningsmiddelområdet er relativt uordnet og uden karakteristika sammenlignet med proteinet. Udglatning af elektrontætheden i opløsningsmiddelområderne vil øge proteins elektrontæthed i en tolkelig grad. Denne metode kaldes ISAS, iterativ enkeltbølgelængde anomal spredning.

Direkte metoderRediger

Den direkte metode kan hjælpe med at genfinde faserne ved hjælp af de data, den opnår. Den direkte metode estimerer de indledende og ekspanderende faser ved hjælp af en tredobbelt relation. Tredobbelt (trio) relation er relationen af intensiteten og fasen af en refleksion med to andre intensiteter og faser. Når man anvender denne metode, har størrelsen af proteinstrukturen betydning, da fasesandsynlighedsfordelingen er omvendt proportionel med kvadratroden af antallet af atomer. Den direkte metode er den mest nyttige teknik til at løse faseproblemer.