Prothrombin spiller en central rolle i blodets koagulation (fig. 1, 2). Dets funktionelle egenskaber hænger sammen med tilstedeværelsen af gamma- carboxyglutamyl (Gla)-rester, som skyldes vitamin K-afhængig posttranslationel carboxylering af ti specifikke glutamylrester (fig. 3, 4). Mine undersøgelser af kvæg (f.eks. undersøgelse af sammenhængen mellem metal-ionbinding og proteinfunktion i “”””””””prothrombinase-komplekset””””””””) vil skelne mellem liganding og de efterfølgende konformationelle inddragelser af Gla-resterne i den normale fysiologiske proces. Inden for denne ramme har jeg tidligere isoleret og karakteriseret seks forskellige Gla-deficiente (0-, 1-, 2-, 3-, 5- og 7-Gla) prothrombinvarianter. Hver af dem dannede kvantitativt thrombin, men med en markant langsommere hastighed (høj K/m) end 10-Gla-protrombin på grund af det kraftige fald i Ca/2+- og fosfolipidbinding sammenlignet med normalt 10-Gla-protrombin. Syv- og mindre-Gla-varianter viste kun 3 % af den normale protrombinaktivitet, målt ved deres evne til at fremskynde koaguleringen af protrombin- og faktor VII-mangelfuldt plasma. Nyligt isolerede 8- og 9-Gla-protrombiner har henholdsvis 18 og 75 % af den normale aktivitet og udgør dermed en overgang mellem 7- og 10-Gla-protrombinerne. Isolering af 8- og 9-Gla-varianter blev mulig ved anvendelse af monoklonale antistoffer (McAb) mod den Ca2+-stabiliserede struktur (Ca II Ab) af protrombin til immunoaffinitetskromatografi. Mine immunokemiske undersøgelser med Ca II Ab, polyklonale og monoklonale, har vist, at de (polyklonale) ikke er specifikke for normalt protrombin, da de krydsreagerer med 7-, 8- og (især) 9-Gla-varianter. Endvidere tyder mine foreløbige data med 5- og 7-Gla-protrombiner på, at Glu-positionerne 15 og 17 ikke er modificerede, og at selektive positioner (resterne 7,8,20,30,33) kan være præferentielt carboxylerede. Den foreslåede undersøgelse vil afsløre, om de Gla-mangelfulde prothrombiner rent faktisk er selektivt mangelfulde, hvilket indikerer rækkefølgen af “”””””””in vivo”””””””” carboxylering af Glu-rester. Min ekspertise i at beskrive, hvordan placeringen og/eller antallet af Gla-rester påvirker de funktionelle, fysisk-kemiske (konformationelle) og immunokemiske egenskaber af protrombin og Gla-holdigt Fragment 1 danner grundlaget for isolering af humant materiale til både grundlæggende og kliniske undersøgelser. Jeg vil isolere normale og de mest afgørende Gla-deficiente prothrombiner. Sidstnævnte vil derefter blive inddelt i to (eller flere) grupper i henhold til deres fysiologiske aktivitet. Målet vil være at overvåge plasmaet hos patienter i warfarinbehandling for normale, 9-Gla (hvis dette er det eneste, der er funktionelt aktivt) og samlede (normale plus Gla-deficient) prothrombiner ved hjælp af immunoassays med specifikke monoklonale antistoffer for at vurdere disse patienters hæmostatiske tilstand.
Sigtet er at fastslå, hvorfor nogle patienter udviser trombotiske episoder, mens andre forbliver mere tilbøjelige til at bløde, selv om deres plasmaprotrombinbioaktivitet opretholdes på et klinisk acceptabelt niveau. Endvidere kan Gla-deficient prothrombiner give en anden markør for leverdysfunktion.