Plantemateriale

Bladene af Strychnos spinosa Lam. blev indsamlet i januar 2013 fra Sakara landsby, Zaria, Nigeria. Plantematerialet blev identificeret af Musa Muhammad, en botaniker fra herbariumsafdelingen på Institut for Biologiske Videnskaber (Ahmadu Bello University, Zaria), hvor der blev deponeret et bilagseksemplar (nr. 900161). De indsamlede blade blev tørret i et ventileret rum uden forurening og derefter formalet til et pulver ved hjælp af en Macsalab-mølle (model 2000 LAB Eriez), opbevaret i en glasbeholder og opbevaret i mørke ved stuetemperatur (25 ± 3 °C) inden brug.

Ekstraktion og væske-væskefraktionering

Aceton-, methanol- og dichlormethan/methanol-ekstraktioner

En variation af Suffness & Douros’ metode blev anvendt til at fraktionere de komponenter, der er til stede i forskellige bladekstrakter. Det tørrede bladpulver (2 kg) blev macereret tre gange i acetone (6 l) for at give acetoneekstrakt (AcetE, 75 g) efter filtrering og fjernelse af opløsningsmidlet i vakuum. Resterne blev yderligere macereret i methanol (6 l) efter samme fremgangsmåde som beskrevet for acetoneekstraktion ovenfor for at opnå methanolekstrakt (MetE, 119,2 g). En del af de tørrede pulveriserede blade (1 kg) blev også ekstraheret i en blanding (1/1, v/v) af dichlormethan/methanol (3 l) tre gange for at opnå dichlormethan/methanol-ekstrakt (DcmMetE, 114 g) efter filtrering og fjernelse af opløsningsmidlet i vakuum. En del af acetoneekstraktet (70 g) blev opløst og fraktioneret i en blanding (1/1, v/v) af chloroform og vand for at give vand- og chloroformfraktionerne. n-butanol blev tilsat til vandfraktionen for at give n-butanol- (nButF, 25,1 g) og vandfraktionerne (Wat1, 5 g). Chloroformfraktionen blev koncentreret til tørhed og opløst i 10 % vand i methanol før ekstraktion med hexan. Hexanfraktionen (HexF, 23,9 g) og residuet af 10 % vand i methanol blev således opnået efter tilsætning af n-hexan. Andelen af vand i methanol blev forøget til 35% vand i methanol-komponent, som endelig gav kloroform (ChlF, 7,05 g) og 35% vand (wat2, 2,8 g) fraktioner efter tilsætning af kloroform. Fra den sammenlignende TLC blev vand (Wat1) og 35% vand i methanol (Wat2) fraktionerne kombineret til én fraktion (WatF, 7,8 g).

Alkaloidekstraktion

Bladene af S. spinosa (1 kg) blev macereret med blandingen (96:3:1, v/v) af EtOAc-EtOH-NH4OH (600 ml) og derefter perkoleret med EtOAc for at give ekstraktet (26 g) efter fjernelse af opløsningsmidlet ved hjælp af roterende inddamper under reduceret tryk. Ekstraktet blev opløst i EtOAc og ekstraheret med 4 % eddikesyre for at opnå EtOAc-fraktion (EtAcF, 20,02 g). Den sure opløsning (pH 3-4) blev basificeret til pH (8-9) med Na2CO3 og ekstraheret tre gange med DCM for at give rå alkaloidekstrakt (AlkE, 2,8 g) efter fjernelse af opløsningsmidlet under vakuum.

Antimikrobiel test

Mikroorganismer og inoculumpræparering

De anvendte mikroorganismer var tre Gram-positive bakterier, Bacillius cereus (ATCC 14579), Staphylococcus aureus (ATCC 29213) og Enterococcus faecalis (ATCC 29212), en Gram-negativ bakterie, Escherichia coli (ATCC 25922); og fire svampe, herunder tre gærsvampe Candida albicans, Cryptococcus neoformans (dyreisolater) og Candida albicans (ATCC 10231) og en filamentøs svamp Aspergillus fumigatus. Nogle af de anvendte svampestammer blev dyrket fra kliniske tilfælde af svampeinfektionssygdomme hos dyr før behandling på afdelingen for veterinære tropesygdomme, Det Veterinærvidenskabelige Fakultet. C. albicans blev isoleret fra en gouldian finch, C. neoformans fra en gepard, mens A. fumigatus blev isoleret fra en høne, der led af en systemisk mykose.

Bakterie- og svampekulturer blev taget fra 24 timers friske agarkulturplader og inokuleret i frisk Sabouraud dextrose bouillon (SDB) for svampe og Mueller-Hinton bouillon (MHB) (Fluka, Schweiz) for bakterier, inden analysen blev udført. Den mikrobielle suspensions turbiditet blev justeret til en McFarland-standard 0,5 svarende til koncentrationer på 1-5 × 108 og 1-5 × 107 cfu/ml for henholdsvis bakterier og svampe. De mikrobielle suspensioner blev yderligere fortyndet (1:100) i medierne for at opnå et endeligt inokulum på ca. 1,5 × 106 cfu/ml for bakterier og 1,5 × 105 cfu/ml for svampe.

Bestemmelse af mindste hæmmende koncentration

En to gange seriel mikrodilutionsmetode med tetrazoliumviolet som indikator for mikrobiel vækst blev anvendt til at bestemme værdierne for mindste hæmmende koncentration (MIC) for ekstrakter og fraktioner mod bakterier og svampe som modificeret af Masoko et al. .

A 100 μl (10 mg/ml) af ekstrakter og fraktioner opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) blev serielt fortyndet to gange med sterilt destilleret vand i mikrotiterplader med 96 brønde, og 100 μl frisk fremstillet mikrobiel kultur i MHB eller SDB blev tilsat til hver brønd. DMSO (5 %) blev anvendt som negativ kontrol, mens (1 mg/ml) gentamicin og amphotericin B var positive kontroller. Mikrotiterpladerne blev forseglet i plastposer og inkuberet i 24 timer ved 37 °C. Derefter blev der tilsat 40 μl 0,2 mg/ml p-iodonitrotetrazoliumviolet (INT) til hver brønd, og mikrotiterpladerne blev yderligere inkuberet ved 37 °C. Minimale hæmmende koncentrationer blev bestemt efter 1 og 2 timer for bakterier og 16 og 36 timer for svampe. MIC blev bestemt som den laveste koncentration, der hæmmer mikrobiel vækst, angivet ved et fald i intensiteten af den røde farve af formazan.

Antioxidantassays

De antioxidante aktiviteter af ekstrakter og fraktioner fra bladene af S. spinosa blev bestemt i form af fri-radikaleffektive evne ved hjælp af 2,2′-diphenyl-1-picryhydrazyl (DPPH) og 2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre) diammoniumsalt (ABTS).

DPPH assay

Den antioxidative aktivitet blev udført som beskrevet af Du Toit et al. med mindre modifikationer. Prøverne blev opløst i methanol af HPLC-kvalitet (Sigma-Aldrich, Tyskland) og to gange serielt fortyndet til koncentrationsintervaller på 1000 til 7,81 μg/ml for ekstrakter og fraktioner og 40 til 0,31 μg/ml for en standardreference L-ascorbinsyre (Sigma, Tyskland). Kort fortalt blev 40 μl (10 mg/ml) af prøverne anbragt i en 96-hullers mikrotiterplade (Bioster, Spanien) og to gange serielt fortyndet i methanol. Derefter blev 160 μl af (3,7 mg/100 ml) methanolisk opløsning af 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl (DPPH) indført i hver brønd, og efter 30 minutters inkubation ved stuetemperatur i mørke blev absorbansen målt ved 517 nm ved hjælp af en Multi-Mode Microplate Reader (BioTek, USA). Den fri-radikale opfangningsaktivitet for hver prøve og referencestandard blev bestemt som procent af den hæmning, der blev opnået ved hjælp af følgende formel:

Med Absample som absorbansen af ekstraktet med DPPH, Abblank som absorbansen af ekstraktet uden DPPH og Abcontrol som absorbansen af methanol og DPPH. Koncentrationen af prøver, der reducerer 50 % af de frie radikaler DPPH (IC50), blev bestemt ved at plotte den procentvise hæmning i forhold til prøvekoncentrationerne. Testen blev gentaget tre gange, og resultaterne er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse.

ABTS-analyse

Den ABTS-radikalopløsende kapacitet af ekstrakter og fraktioner blev bestemt ved hjælp af en metode af Re et al. med mindre modifikationer. Kort fortalt blev ABTS-radikalet genereret ved at lade 7 mM opløsning af ABTS og 2,45 mM opløsning af kaliumpersulfat reagere ved stuetemperatur i 12 timer. Absorbansen af ABTS-radikal-stamopløsningen blev justeret til 7,00 ± 0,02 ved 734 nm, inden den blev anvendt. 40 μl af en opløsning af ekstrakter eller fraktioner opløst i methanol af HPLC-kvalitet (Sigma-Aldrich, Tyskland) blev overført til mikrotiterplader og fortyndet to gange serielt til koncentrationer på 15,62 og 2000 μg/ml. Trolox (Sigma, Tyskland) og L-ascorbinsyre (Sigma, Tyskland) blev fremstillet i koncentrationer fra 200 til 1,56 μg/ml. Derefter blev 160 μl ABTS-opløsning tilsat til brøndene (undtagen blindprøven), og absorbansen blev målt ved 734 nm efter 6 minutters inkubation ved stuetemperatur. Trolox og ascorbinsyre blev anvendt som positiv kontrol, methanol som negativ kontrol og ekstrakter eller fraktioner uden ABTS som blindprøve. Procentdelen af ABTS-+ hæmning og IC50 blev beregnet som rapporteret ovenfor for DPPH-assay.

Cytotoksicitetsassay

Cytotoksiciteten af acetoneekstrakterne og fraktionerne mod Vero abenyreceller blev vurderet ved hjælp af MTT-reduktionsassay som tidligere beskrevet med mindre ændringer. Cellerne blev udsået med en tæthed på 1 × 105 celler/ml (100 μl) i 96-well mikrotiterplader og inkuberet ved 37 °C og 5 % CO2 i et befugtet miljø. Efter 24 timers inkubation blev prøver (100 μl) i forskellige slutkoncentrationer tilsat til brøndene med celler. Doxorubicin blev anvendt som en positiv reference. Der blev også medtaget en passende blindkontrol med tilsvarende koncentrationer af acetone, og pladerne blev yderligere inkuberet i 48 timer i et CO2-inkuberingsanlæg. Derefter blev mediet i hver brønd suget fra cellerne, som derefter blev vasket med PBS, og til sidst blev der tilsat frisk medium (200 μl) til hver brønd. Derefter blev der tilsat 30 μl MTT (5 mg/ml i PBS) til hver brønd, og pladerne blev inkuberet ved 37 °C i 4 timer. Mediet blev suget fra brøndene, og der blev tilsat DMSO for at opløse de dannede formazankrystaller. Absorbansen blev målt på en BioTek Synergy-mikropladelæser ved 570 nm. Hæmning af cellevækst for hvert ekstrakt blev udtrykt som LC50-værdier, defineret som den koncentration, der forårsagede 50 % hæmning af cellernes levedygtighed. Værdierne for selektivitetsindekset (SI) blev beregnet ved at dividere cytotoksicitets-LC50-værdierne med MIC-værdierne (SI = LC50/MIC). Forsøg blev udført i fire eksemplarer, og hvert forsøg blev gentaget tre gange.

Statistisk analyse

Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer, og værdierne blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse. Forskelle mellem værdierne blev vurderet for signifikans ved hjælp af variansanalyse, og resultaterne blev sammenlignet ved hjælp af Fisher’s mindst signifikante forskel (LSD) ved 5 % signifikansniveau.