PMC
Using NEBcutter
NEBcutter accepterer en inputsekvens, som kan indsættes, hentes fra en lokal fil eller hentes fra NCBI som en GenBank-fil via dens accession-nummer. Der er forskellige muligheder for at vælge størrelsen af de ORF’er, der skal vises, og det sæt restriktionsenzymer, der skal anvendes. Programmet beregner positionerne for alle restriktionsenzymsteder, idet der tages hensyn til dem, der potentielt kan være blokeret af overlappende methylering, og finder ORF’erne i sekvensen. Derefter viser det et skematisk diagram af sekvensen, de lange ORF’er, baseret på de regler, der er beskrevet i Metoderne, og alle restriktionsenzymer, der skærer den en enkelt gang. Den indledende visning viser også de enzymer, der kan anvendes i en komplet fordøjelse for at skære hver ORF, der vises, ud. Figur Figur11 viser en typisk digest, i dette tilfælde en lineær visning af plasmidet pBR322. Hvis den oprindelige DNA-sekvens er cirkulær, tilbydes både lineære og cirkulære visninger. Fra den indledende visning er der mange muligheder for at gå videre, herunder brugerdefineret fordøjelse med enzymer efter eget valg og forskellige visninger af digesten. Det er også muligt fra lineære visninger at zoome ind på et udvalgt område af sekvensen for at få en mere detaljeret visning. En mulighed gør det muligt at vælge en bestemt region, og de enzymer, der skærer umiddelbart ved siden af regionen, kan vises. Dette er nyttigt for at finde enzymer, der er i stand til at skære den ønskede region. Hvis zooming fører til et område på <60 nukleotider, vises den faktiske sekvens (Fig. (Fig.2),2), sammen med en eventuel oversættelse, der er relevant. På denne visning vises alle enzymer, der skærer sekvensen, alle baser, der udgør dele af en genkendelsessekvens for et restriktionsenzym, er fremhævet, og hvis man bevæger musen over et enzymnavn, fremkommer en boks med genkendelsessekvensen noteret, og selve sekvensen bliver understreget i visningen.
Den lineære visning af en digest af plasmidet pBR322. Bemærk, at de to vigtigste ORF’er er flankeret af steder (MseI og PflMI; BspHI og EarI), som kunne bruges til at udskille dem fra den komplette plasmidsekvens. I denne visning er kun enzymer, der kløver sekvensen én gang, vist. Valgmuligheder for yderligere fordøjning og visning er tilgængelige via knapperne nederst i visningen.
Zoomet visning af en kort region fra pBR322. Bemærk, at de baser, der er fremhævet med rød og blå, udgør dele af genkendelsessteder for restriktionsenzymer. De røde er entydige, mens de blå er degenererede baser. BsiEI genkender således sekvensen CGRYCG. De ydre CG-rester er invariante, mens de indre baser er degenererede og i den viste specifikke sekvens er GT. Baser, der er vist med sort, er ikke en del af et genkendelsessted for et restriktionsenzym. Denne visning kan være nyttig til at finde restriktionsenzymer, der kan skelne SNP-alleler.
På en hvilken som helst hovedvisning vises ved at føre musen hen over et restriktionsenzymnavn dets genkendelsessekvens og det præcise basenummer, hvor det kløver. Hvis der er mere end ét sted for enzymet, er alle andre steder understreget. Hvis man klikker på enzymnavnet, vises en side med et resumé af oplysninger om enzymet, herunder dets methyleringsfølsomhed, de typer ender, der produceres, isoschizomerer, der er tilgængelige, og en liste over andre enzymer, der kan producere kompatible ender. For NEB-enzymer gives oplysninger om fordøjelsesbetingelser og et link til NEB-webstedet.
En vigtig egenskab ved NEBcutter er, at den indarbejder alt, hvad der er registreret i REBASE om methyleringsfølsomheden for et af de viste enzymer, når de overlapper et Dam-sted (GATC), et Dcm-sted (CCWGG), et CpG-sted, et EcoKI-sted (AACN6GTGC) eller et EcoBI-sted (TGAN8TGCT). Når der udføres teoretiske digester, omfatter resultaterne en sammenligning af methyleringens virkninger, der fremhæver de bånd, der forskydes (Fig. (Fig.33).
En teoretisk digest, der viser virkningerne af overlappende Dcm-methylering på de MscI-steder (genkendelsessekvens: TGGCCA), der er til stede i sekvensen, hvis bakteriofagen lambda var blevet dyrket i en E.coli-stamme, der udtrykker Dcm-methyltransferase (genkendelsessekvens: CCWGG). Fragmenter, der er påvirket af Dcm-methylering, er vist med rødt. Den virtuelle gel er baseret på interpolation af en kubisk spline-kurve genereret fra eksperimentelle data produceret med fragmenter af kendt størrelse.
På hver side er der hot links, der fører tilbage til hovedsiden, giver hjælp til at fortolke visningen eller giver brugerne mulighed for at sende kommentarer tilbage til forfatterne. Grænsefladen er designet til at være så intuitiv som muligt og til at give let adgang til de vigtigste funktioner, der er nyttige for forskere, der forsøger at kløve deres DNA. Den nuværende version af NEBcutter har behandlet mere end 400 000 sekvenser fra brugere. Vi er i øjeblikket ved at forberede en række forbedringer af NEBcutter, og version 2.0 er planlagt til udgivelse den 1. juli.