Det centrale dogme i molekylærbiologien er DNA→RNA→Protein. For at syntetisere et bestemt protein skal DNA først transskriberes til messenger RNA (mRNA). mRNA kan derefter oversættes på ribosomet til polypeptidkæder, der udgør proteiners primære struktur. De fleste proteiner modificeres derefter via en række posttranslationelle modifikationer, herunder proteinfoldning, dannelse af disulfidbroer, glykosylering og acetylering, for at skabe funktionelle, stabile proteiner. Proteinekspression henviser til det andet trin i denne proces: syntese af proteiner fra mRNA og tilføjelse af posttranslationelle modifikationer

Lær mere om molekylærbiologi i vores e-bog Plasmider 101!

Forskere bruger forskellige teknikker til at kontrollere proteinekspression til eksperimentelle, bioteknologiske og medicinske formål. Forskere kan visualisere proteiner in vivo ved at markere dem med fluorescerende proteiner for at studere lokalisering eller rense proteiner for at studere deres struktur, interaktioner og funktioner. Proteiner kan også oprenses til brug i molekylærbiologisk forskning (f.eks. kan polymeraser og andre enzymer oprenses og bruges til at manipulere DNA) eller i medicin (f.eks. insulin).

Proteiner skal i modsætning til DNA, der relativt let kan syntetiseres, fremstilles ved hjælp af komplekse blandinger, der stammer fra celler eller ved hjælp af levende celler. Der findes flere typer ekspressionssystemer, der anvendes til fremstilling og rensning af proteiner. Disse omfatter pattedyr-, insekt-, bakterie-, plante-, gær- og cellefri ekspressionssystemer.

Overordnet set består den generelle strategi for proteinekspression i at transficere celler med den ønskede DNA-skabelon og lade disse celler transskribere, oversætte og modificere det ønskede protein. De modificerede proteiner kan derefter ekstraheres fra lyserede celler ved hjælp af proteintags og adskilles fra forurenende stoffer ved hjælp af en række forskellige oprensningsmetoder. Beslutningen om, hvilket ekspressionssystem der skal anvendes, afhænger af flere faktorer:

1. Det protein, du forsøger at udtrykke
2. Hvor meget protein du har brug for
3. Dine planer for downstream-applikationer

I dette blogindlæg vil vi opsummere nogle af de mere almindelige ekspressionssystemer, herunder deres fordele og forbehold, som du skal være opmærksom på, før du vælger et system.

Pattedyrs ekspressionssystemer

Pattedyrsceller er et ideelt system til ekspression af pattedyrsproteiner, som kræver flere posttranslationsmodifikationer for korrekt proteinfunktion. De fleste DNA-konstruktioner, der er designet til pattedyrsekspression, anvender virale promotorer (SV40, CMV og RSV) for at opnå robust ekspression efter transfektion. Pattedyrsystemer kan udtrykke proteiner både transient og gennem stabile cellelinjer. Begge metoder giver et højt proteinudbytte, hvis transfektionen er vellykket.

Nogle pattedyrsystemer giver også mulighed for at kontrollere, hvornår et protein udtrykkes, ved hjælp af konstitutive og inducerbare promotorer. Inducerbare promotorer er yderst nyttige, hvis et ønsket proteinprodukt er giftigt for cellerne ved høje koncentrationer. På trods af deres fordele kræver pattedyrsudtrykssystemer krævende cellekulturbetingelser sammenlignet med andre systemer.

Insektudtrykssystemer

Insektceller kan også bruges til at fremstille komplekse eukaryote proteiner med de korrekte posttranslationelle modifikationer. Der findes to typer insektudtrykssystemer; baculovirus-inficerede og ikke-lytiske insektceller.

Baculovirus-ekspressionssystemer er meget effektive til rekombinant proteinekspression på højt niveau. Disse systemer muliggør høj ekspression af meget komplekse, glykosylerede proteiner, som ikke kan produceres i E. coli- eller gærceller. Det eneste problem med baculovirus-systemer er, at den inficerede værtscelle til sidst bliver lyseret. Cellelysis stopper proteinproduktionen, men der findes ikke-lytiske insektcelleekspressionssystemer (sf9-, Sf21- og Hi-5-celler), som giver mulighed for kontinuerlig ekspression af gener, der er integreret i insektcellens genom. Begge disse typer insektekspressionssystemer kan opskaleres med henblik på produktion af store mængder protein.

Nogle ulemper ved insektcelleekspressionssystemer er, at virusproduktion kan være ret tidskrævende, og at insektceller kræver krævende kulturbetingelser svarende til ekspressionssystemer til pattedyr.

Bakterielle ekspressionssystemer

Når man ønsker at producere store mængder protein hurtigt og billigt, er en bakteriel værtscelle næsten altid svaret. E. coli er helt klart en af de mest populære værter til proteinekspression med flere stammer, der er specialiseret til proteinekspression. Proteinekspression i bakterier er ganske enkel; DNA, der koder for det ønskede protein, indsættes i en plasmidekspressionsvektor, som derefter transformeres i en bakteriecelle. De transformerede celler formerer sig, induceres til at producere det ønskede protein og lyseres derefter. Protein kan derefter oprenses fra celleaffaldet.

Der findes flere populære DNA-vektorer, som kan anvendes til at producere store mængder protein i bakterieceller: f.eks. pET-, pRSET-, Gateway pDEST- og pBAD-vektorerne. Proteinekspression fra hver af disse vektorer styres af en anden promotor, hvilket resulterer i forskellige ekspressionsniveauer fra hver vektor; lavere ekspression kan være nødvendig, hvis dit protein er giftigt for E. coli. Af alle vektorerne giver pET, der er under kontrol af T7 lac-promotoren og induceret af laktose, det højeste niveau af proteinekspression.

Trods deres brugervenlighed er det vigtigt at bemærke, at bakterier normalt ikke kan producere funktionelle multi-domæneproteiner fra pattedyr, da bakterieceller ikke er udstyret til at tilføje passende posttranslationelle modifikationer. Desuden bliver mange proteiner, der produceres af bakterier, uopløselige og danner inklusionskroppe, som er vanskelige at ekstrahere uden skrappe reagenser og tålmodighed.

Planteekspressionssystemer

Planter er et billigt og lavteknologisk middel til masseekspression af rekombinante proteiner. Mange celler fra forskellige typer planter som f.eks. majs, tobak, ris, sukkerrør og endda kartoffelknolde er blevet anvendt til proteinekspression.

Plantesystemer har mange af de samme egenskaber og behandlingskrav som ekspressionssystemer fra pattedyrsceller, herunder størstedelen af de komplekse posttranslationelle modifikationer. Ekstraktion og oprensning af rekombinante proteiner fra planter kan imidlertid være dyrt og tidskrævende, da plantevæv i sig selv er biokemisk komplekse.

For at omgå disse problemer har forskerne draget fordel af den naturlige sekretion af biokemikalier og proteiner gennem planterødder. Ved at mærke rekombinante proteiner med et naturligt udskilt plantepeptid kan man lettere få adgang til og rense et ønsket protein. På trods af at det er en ret ny teknologi, er planteceller blevet brugt til at udtrykke en lang række proteiner, herunder antistoffer og lægemidler, især interleukiner.

Yeast-ekspressionssystemer

Yeast er et fantastisk ekspressionssystem til at generere store mængder rekombinante eukaryote proteiner. Selv om mange gærarter kan anvendes til proteinekspression, er S. cerevisiae den mest pålidelige og hyppigt anvendte art på grund af dens anvendelse som modelorganisme inden for genetik og biokemi.

Ved anvendelse af S. cerevisiae placerer forskere ofte rekombinante proteiner under kontrol af den galactose-inducerbare promotor (GAL). Andre almindeligt anvendte promotorer omfatter de fosfat- og kobberinducerbare PHO5- og CUP1-promotorer henholdsvis. Gærceller dyrkes i veldefinerede medier og kan let tilpasses til fermentering, hvilket giver mulighed for stabil produktion af proteiner i stor skala.

Generelt er gærekspressionssystemer lettere og billigere at arbejde med end pattedyrceller, og de er ofte i stand til at modificere komplekse proteiner i modsætning til bakteriesystemer. Gærceller har imidlertid en langsommere væksthastighed end bakterieceller, og dyrkningsbetingelserne skal ofte optimeres. Gærceller er også kendt for at hyperglykosylere proteiner, hvilket kan være et problem afhængigt af dit foretrukne protein.

Cellefri ekspressionssystemer

I cellefri ekspressionssystemer samles proteiner in vitro ved hjælp af oprensede komponenter af transkriptions- og translationsmaskineriet. Disse omfatter ribosomer, RNA-polymerase, tRNA’er, ribonukleotider og aminosyrer. Cellefrie ekspressionssystemer er ideelle til hurtig samling af mere end ét protein i én reaktion. En stor fordel ved disse systemer er deres evne til at samle proteiner med mærkede eller modificerede aminosyrer, som er nyttige i forskellige downstream-applikationer. Cellefrie ekspressionssystemer er imidlertid dyre og meget teknisk udfordrende at anvende.

Alyssa D. Cecchetelli er forsker hos Addgene. Hun har fået sin ph.d. fra Northeastern University og er især interesseret i cellesignalering og kommunikation. Hun elsker at kunne hjælpe det videnskabelige samfund med at dele plasmider.

Supplerende ressourcer

• Thermofisher Protein Expression Systems
• Rekombinant proteinekspression i Escherichia coli: fremskridt og udfordringer
• Produktion af rekombinante proteiner i planterodsekssudater