Nytten af organiske syrer produceret af Exiguobacterium sp. 12/1 ved neutralisering af alkalisk spildevand
Abstract
Sigtet med denne undersøgelse var at undersøge den rolle, som organiske syrer produceret af Exiguobacterium sp. stamme 12/1 (DSM 21148) spiller ved neutralisering af alkalisk spildevand fra drikkevareindustrien. Denne bakterie er kendt for at kunne vokse i et medium med en pH-værdi på op til 12,0 og for at kunne neutralisere alkalisk industrielt spildevand fra pH 12,0 til pH 7,5. Den indledende undersøgelse af typen af funktionelle grupper i mediet, der blev udført ved hjælp af FT-IR-spektroskopi, afslørede tilstedeværelsen af toppe svarende til carbonyl- og hydroxylgrupper, hvilket tyder på frigivelse af carboxylsyre eller beslægtede metaboliske produkter. Identifikation af en specifik carboxylgruppe ved hjælp af RP-HPLC afslørede tilstedeværelsen af en enkelt top i kultursupernatanten med en retentionstid, der mest ligner myresyre. Koncentrationen af den syre, der blev produceret på forskellige kulstofkilder, blev undersøgt som en funktion af tiden. Selv om syren var til stede i samme slutkoncentration, var syreproduktionen størst i et medium suppleret med saccharose efterfulgt af fructose og glucose. Kendskabet til bakteriens metaboliske produkter kan betragtes som et første skridt hen imod realisering af dens potentiale til bioremediering i stor skala af alkalisk spildevand fra drikkevareindustrien.
1. Indledning
Alkalifile – mikroorganismer, der har pH-optima for vækst ved eller over pH 9 – har haft stor betydning i industrielle anvendelser. Biologiske vaske- og rengøringsmidler indeholder enzymer som f.eks. alkaliske cellulaser og/eller alkaliske proteaser, der er fremstillet af alkalifiler . Alkalifile er også blevet anvendt til industriel fremstilling af enzymer til specifik anvendelse, f.eks. cyclodextrin ved hjælp af alkalisk cyclomaltodextrin-glucanotransferase og alkalisk aktiv maltohexaose-dannende α-amylase, som anvendes i fødevare-, kemiske og farmaceutiske industrier. Det er blevet rapporteret, at alkalibehandlet træmasse kan bleges biologisk ved hjælp af xylanaser produceret af alkalifiler . Fujiwara og medarbejdere har rapporteret om anvendelse af en alkalisk protease til nedbrydning af gelatineagtige belægninger på røntgenfilm, hvorfra der blev genvundet sølv. Alkalifile har også vist deres potentiale i bionedbrydning af en række organiske forbindelser .
Så har alkalifile bakterier tiltrukket sig stor interesse på grund af deres ekstracellulære enzymer og biokemiske egenskaber som f.eks. alkalifili og alkalistabilitet. Deres bioenergetik er også blevet undersøgt ret detaljeret , mens man kun ved lidt om deres fysiologi, f.eks. om intracellulære enzymer og metabolitter. Egenskaberne ved den mellemliggende metaboliske proces er vigtige, da de bidrager til at karakterisere bakterien, dens enzymsammensætning, cellernes metaboliske fase og mulighederne for metabolisk teknik. Alkaliphiles evne til at ændre pH-værdien i et kulhydratholdigt medium blev udnyttet i tidligere arbejde til neutralisering af stærkt alkalisk spildevand fra drikkevareindustrien ved hjælp af Exiguobacterium sp. stamme 12/1 . Slægten Exiguobacterium tilhører ordenen Bacillales, som også omfatter medlemmer af slægten Bacillus. Exiguobacterium sp. 12/1 er en fakultativ alkalifil, der vokser optimalt ved pH 10 og er i stand til at neutralisere alkalisk spildevand og bringe det ned fra pH 12,0 til pH 7,5. Det antages, at bakterien frigiver et eller flere sure stofskifteprodukter for at neutralisere det stærkt basiske eksterne medium. Det er imidlertid vigtigt at karakterisere den type metabolitter, der frigives til det ekstracellulære medium. Her undersøger vi produktionen af organiske syrer som en mulig mekanisme for alkali-neutralisering. Sådanne typer undersøgelser vil være nødvendige, før der kan udvikles storstilede anvendelser af bakterien til neutralisering af alkalisk spildevand fra drikkevareindustrien.
Den vigtigste kulstofkilde i spildevand fra læskedrikkeindustrien er saccharose (disaccharid indeholdende glukose og fruktose), som også er den vigtigste bidragsyder til dets biokemiske iltforbrug (BOD) . Det gennemsnitlige BOD-indhold i spildevand fra læskedrikkeindustrien ligger mellem 600 og 4 500 mg/L, hvilket svarer til 673-5052 ppm saccharose. En litteraturundersøgelse af de metaboliske produkter fra et stort antal bakterier, der vokser på simple sukkerarter, tyder på, at bakterierne kan udnytte disse simple sukkerarter til at generere organiske syrer. Dette bekræftes yderligere af analysen af ekstracellulære metaboliske produkter fra andre alkalifile Bacillus-arter . Den vigtigste organiske syre, der blev produceret på saccharose som kulstofkilde i disse undersøgelser, viste sig at være eddikesyre. Myresyre er en almindelig metabolit hos neutrofile bakterier under anaerobe forhold, mens B. circulans var. alkalophilus producerer op til 2 g/L af den, selv i aerobe kulturer. Andre flygtige syrer såsom propionsyre, smørsyre, isobuttersyre og isovaleriske syrer er typiske for stammerne Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus og Bacillus sp. 17-1. Isobuttersyre og isovaleriske syrer er blevet rapporteret i medierne hos flere neutrofile baciller . Men disse syrer samt propionsyre og smørsyre anses for at stamme fra aminosyrer på grundlag af undersøgelser af Clostridium sp. . Mælke- og pyrubrinsyre produceres ret almindeligt af neutrofile baciller , men produktion af bikseddikesyre af Bacillus er sjælden . Ethanol er ikke blevet påvist i alkalifile baciller, selv om det er et typisk produkt af glukosekulturer af mange neutrofile baciller . Alkaliske vækstbetingelser kan således påvirke produktionen af de neutrale metabolitter . I denne undersøgelse har vi anvendt omvendt fase højtydende væskekromatografi til at undersøge type og koncentration af syrer produceret af Exiguobacterium sp. stamme 12/1 under neutralisering af et medium med høj pH indeholdende forskellige typer kulstofkilder.
2. Materialer og metoder
2.1. Stamme og kulturbetingelser
Exiguobacterium sp. 12/1-kulturen blev indhentet fra DSMZ (DSM 21148) og blev opbevaret som glycerollagre. Alkalisk basalmedium (ABM) indeholdende (alle koncentrationer i g/L): pepton, 1; gærekstrakt, 0,5; glukose, 1; K2HPO4, 0,1; Na2CO3, 1; pH 10 (de sidste tre komponenter blev tilsat det autoklaverede medium fra separat steriliserede opløsninger) blev anvendt til rutinemæssig dyrkning af stamme 12/1 ved 37 °C. Til IR- og RP-HPLC-analyse blev bakterien dyrket ved 37°C, 200 rpm i minimalt saltmedium (MSM) indeholdende (alle koncentrationer i mM): 004; (NH4)2SO4, 5 og 1 % (w/v) af et af følgende kulhydrater: glukose, fructose eller saccharose (alle komponenter tilsættes fra de separat autoklaverede koncentrerede stamopløsninger). Mediets endelige pH-værdi blev justeret til 10,5 ved hjælp af 1 N NaOH.
2,2. Analyse af vækst og kulturens pH
1 mL logfasekultur på ABM blev anvendt til at inokulere prækulturer (50 mL) (MSM indeholdende 1 % sukker). Den egentlige testkultur (250 mL MSM i 500 mL Erlenmeyer-kolbe) blev inokuleret med hele prækulturen i mid-log-fase (O.D. ~ 1,2). Hvert kultursæt bestod af tre kolber. Prøvernes absorbans ved 650 nm blev anvendt som mål for bakterievækst. pH-værdien blev bestemt i cellefrie kulturprøver ved stuetemperatur efter centrifugering 4000 ×g i 20 min.
2.3. FT-IR-analyse
Kulturen blev høstet efter 60 timers vækst og blev centrifugeret ved 4000 ×g i 20 min. Til IR-analyse blev kulturens supernatant frysetørret og knust til pulverform. Den pulveriserede supernatant blev derefter blandet med kaliumbromid, og blandingen blev presset til en tablet. Endelig blev tabletten analyseret ved hjælp af FT/IR-4200-spektrometeret (JASCO, Tokyo, Japan).
2.4. RP-HPLC-analyse
Kulturen blev høstet på forskellige tidspunkter og blev centrifugeret ved 4000 ×g i 20 minutter. Til HPLC-analyse blev kulturens supernatant filtreret gennem et 0,22 μm-filter, og 10 μL af den filtrerede prøve blev injiceret i HPLC-kolonnen.
Analytisk myresyre, eddikesyre, eddikesyre, succinsyre, propionsyre, mælkesyre og isobuttersyre af standardkvalitet blev indhentet fra Sigma. Der blev fremstillet standardopløsninger (100 mg/mL eller 100 μL/mL), som blev opbevaret ved 4 °C til videre brug. Arbejdsstandardopløsninger (10 mg/mL eller 10 μL/mL) blev fremstillet dagligt. Milli-Q-vand (Millipore) blev anvendt til fremstilling af buffer- og stamopløsninger af hver forbindelse og prøver. Stamopløsninger, prøver og buffer blev filtreret gennem Whatman-filtre med cellulosemembran (0,45 μm, Whatman, Clifton, NJ, USA). Opløsningsmidlerne blev afgaset under vakuum før brug.
Den organiske syreanalyse blev udført i henhold til Tormo og Izcos metode . Analysen blev udført på et Breeze System (Waters, Mildford, MA, USA) bestående af en 1525 binær HPLC-pumpe, en 717 plus autosampler og en 2487 to-kanals UV-detektor indstillet på 210 nm, betjent ved hjælp af en Breeze-software. Separationen blev foretaget på en Atlantis dC18-kolonne (Waters) 250 × 4,6 × 5 μm. Der blev dagligt fremstillet 20 mM NaH2PO4 justeret til pH 2,20 med fosforsyre, som blev filtreret gennem 0,2 μm hydrofil membraner (Millipore). Opløsningsmiddelprogrammet anvendte to beholdere med 1 % acetonitril i 20 mM fosfatbuffer justeret til pH 2,20 med fosforsyre (opløsningsmiddel A) og acetonitril (opløsningsmiddel B); strømningshastigheden blev indstillet til 1,5 mL/min ved stuetemperatur. Gradientprogrammet startede med 100 % af opløsningsmiddel A og efter 7 min blev opløsningsmiddel B øget lineært for at nå 7 % i løbet af 5 min. Fra 12 til 19 min blev hastigheden holdt på 93 % af opløsningsmiddel A og 7 % af opløsningsmiddel B. Derefter blev hastigheden ændret til startbetingelserne for at equilibrere søjlen i 15 min, inden der igen injiceres 10 μL af den næste prøve.
3. Resultater
3.1. Analyse af neutralisering på defineret medium
Minimumsaltmedium blev valgt til analyse af organisk syre produceret af bakterien på grund af dets definerede karakter og lignende kulstofkilde som drikkevareindustriens spildevand. Bakterien fik lov til at vokse i et minimalt saltmedium suppleret med forskellige kulstofkilder glukose, fruktose og saccharose. Figur 1 viser vækstprofilen og pH-karakteristika for mediet med tiden. Fructose og saccharose gav en meget hurtigere neutralisering af mediet sammenlignet med glucose. Den endelige pH-værdi, der blev opnået med glukose, var også lidt højere end den, der blev opnået i forbindelse med saccharose- og fructosetilskudt medium. Dette afspejler sig også i vækstprofilen for bakterien dyrket på de tre kulstofkilder. Bakterierne voksede hurtigere i saccharose efterfulgt af fructose og glucose.
(a)
(b)
(a)
(b)
Variation i pH (a) og O.D. (b) med tiden på MSM. Værdierne repræsenterer gennemsnittet af tre gentagne målinger, og fejlbjælkerne repræsenterer standardafvigelsen.
3.2. Identifikation af funktionel gruppe til stede i kultursupernatanten
For at identificere den funktionelle brede funktionelle gruppe af den metabolit, der produceres af bakterien for at neutralisere alkalisk spildevand, blev den frysetørrede kultursupernatant underkastet FT-IR-spektroskopi. To toppe svarende til carbonylgruppen (ved 1644,98 cm-1) og hydroxylgruppen (ved 3436,74 cm-1) var til stede i spektret (tabel 1). Ifølge litteraturundersøgelsen producerer bakterien højst sandsynligt organiske syrer som et metabolisk produkt, der neutraliserer det alkaliske spildevand.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.3. Identifikation af bakteriens specifikke metaboliske produkt
For at identificere den organiske syre, der produceres af bakterien, blev der udført HPLC i omvendt fase ved hjælp af kendte standarder for organiske syrer udvalgt efter en litteraturundersøgelse. Standarderne blev kørt både individuelt (figur 2(a)) og i blanding (figur 2(b)) for at konstatere eventuelle forskelle i retentionstiden som følge af interferens fra andre organiske syrer i mediet. RT for standardorganiske syrer i de to tilfælde viste sig at være ens, idet forskellen i retentionstid ikke oversteg 0,09 enheder, undtagen for propionsyre (tabel 2). Kulturens supernatant blev analyseret efter samme metode og viste sig at bestå af et enkelt peak med en retentionstid svarende til myresyre. Dette blev yderligere bekræftet ved at tilsætte standardmyresyre til supernatanten, hvis top overlejredes med toppen af produktet i supernatanten (figur 2(d)).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
RP-HPLC-kromatogrammer af de enkelte organiske standardsyrer (a), organiske standardsyrer i blanding (b), kultursupernatant (c) og kultursupernatant tilsat myresyre.
3.4. Kvantitativ analyse af bakteriens metaboliske produkt
Til den kvantitative analyse af kultursupernatant blev der kørt forskellige standardkoncentrationer af myresyre, og toparealet svarende til hver koncentration blev beregnet. Toparealet blev plottet mod koncentrationen for at opnå en standardkurve (figur 3). Denne standardkurve blev anvendt til at beregne den mængde syre, der produceres med tiden på minimumsaltmedium suppleret med forskellige kulstofkilder. Bakteriens kultursupernatant blev analyseret tidsafhængigt og blev igen underkastet Reverse Phase HPLC-analyse. Det blev fundet, at toppen af det vigtigste produkt i bakteriekulturens supernatant stiger med tiden. Retentionstiden for syren svarer til den for myresyre. Undersøgelsen af myresyre produceret med forskellige kulstofkilder som en funktion af tiden er vist i figur 4. Den største mængde syre blev produceret i tilfælde af MSM suppleret med saccharose efterfulgt af fructose og glucose.
Standardkurve for bestemmelse af koncentrationen af myresyre i kultursupernatanten.
Variation i mængden af organisk syre produceret med tiden på MSM suppleret med forskellige kulstofkilder. Værdierne repræsenterer gennemsnittet af tre gentagne målinger, og fejlbjælkerne repræsenterer standardafvigelsen.
4. Diskussion
Den vigtigste kulstofkilde i spildevandet fra drikkevareindustriens spildevand er saccharose . Til analyse af det metaboliske produkt, der produceres under neutralisering, blev der derfor valgt et veldefineret minimumsaltmedium, der indeholder saccharose og de to monosaccharidsukkere – glucose og fructose – som bestanddele. Vækstkarakteristikken af stamme 12/1 på minimale saltmedier suppleret med de tre kulstofkilder viser en effektiv neutralisering samtidig med væksten (figur 1(a) og 1(b)). Faldet i vækstmediets pH-værdi skyldes nødvendigvis enten dannelse af syrer eller fjernelse af baser .
Produktionen af syrer er veldokumenteret for bakterier, der dyrkes på simple sukkerarter. Stofskifteprodukterne fra nogle alkalifile medlemmer af Bacillus-slægten er blevet undersøgt . Den vigtigste organiske syre, der blev produceret på saccharose som kulstofkilde i disse undersøgelser, viste sig at være eddikesyre. Genomsekvenserne af alkalifile Bacillus-arter – Bacillus pseudofirmus OF4, Bacillus halodurans og Bacillus clausii-understøtter også denne observation, da alle disse arter har en funktionel omdannelsesvej fra pyruvat til acetat. Myresyre er en almindelig metabolit hos neutrofile bakterier under anaerobe forhold, mens B. circulans var. alkalophilus producerer op til 2 g/L af den, selv i aerobe kulturer. Andre flygtige syrer som f.eks. propionsyre, smørsyre, isobuttersyre og isovalerisyre er typiske for stammerne Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus og Bacillus sp. 17-1. Isobutyric- og isovaleric-syrer er blevet rapporteret i medierne hos flere neutrofile baciller . Men disse syrer samt propionsyre og smørsyre anses for at stamme fra aminosyrer på grundlag af undersøgelser af Clostridium sp. . Mælke- og pyrubrinsyre produceres ret almindeligt af neutrofile baciller , men produktion af bikseddikesyre af Bacillus er sjælden . Ethanol er ikke blevet påvist i alkalifile baciller, selv om det er et typisk produkt af glukosekulturer af mange neutrofile baciller . Alkaliske vækstbetingelser kan således påvirke produktionen af de neutrale metabolitter.
De første undersøgelser af metaboliske produkter hos Bacillus sp. blev udført ved hjælp af titrimetrisk procedure . Den øgede bufferingsevne i bakteriekulturens supernatant omkring pH 5, som er det typiske område for protonering af carboxylsyrer, blev brugt til at opstille den hypotese, at mediet indeholder carboxylsyrer. I denne undersøgelse har vi anvendt FT-IR-spektroskopi til at fastslå den funktionelle gruppe af den eller de forbindelser, der er til stede i kulturoverskuddet. FT-IR-spektrografen viste toppe, der er karakteristiske for carbonylgruppe (ved 1644,98 nm) og hydroxylgruppe (ved 3436,74 nm) (tabel 1), hvilket tyder på tilstedeværelsen af en kemisk art bestående af hydroxyl- og carbonylgruppe, og det er mest sandsynligt, at det er carboxylsyre.
Den omvendte fase HPLC-metode blev anvendt til at analysere de organiske syrer, der er til stede i kultursupernatanten . HPLC-betingelserne blev valgt til den bedst rapporterede opløsning, dvs. pH 2,2 og 1% acetonitril. Omvendt fase HPLC-metoden er fordelagtig på grund af anvendelsen af billigere kolonner, lettere manipulation af analyseparametrene for at optimere adskillelsen og analyser ved stuetemperatur . Metoden blev først anvendt til at beregne retentionstiden for de syrestandarder, der var udvalgt i henhold til litteraturundersøgelsen. Rækkefølgen af syreelutionen under disse betingelser var den samme som den, der er rapporteret i Tormo og Izco , men der var variation i retentionstiderne i denne undersøgelse og i Tormo og Izco . Denne variation kan tilskrives forskellen i HPLC-betingelserne, f.eks. temperaturen 25-30°C i denne undersøgelse i forhold til 24°C ± 1°C rapporteret i Tormo og Iczo .
RP-HPLC af kultursupernatanten viser tilstedeværelsen af et enkelt peak med absorbans ved 211 nm, som er den karakteristiske absorptionsbølgelængde for organiske syrer. Supernatanten indeholder således en enkelt kemisk art, som højst sandsynligt er en organisk syre. Sammenligningen af retentionstiden for denne top og retentionstiden for standardorganiske syrer viser, at retentionstiden mest ligner myresyre. Denne observation blev yderligere bekræftet ved at tilsætte myresyre til kultursupernatanten, hvilket øger produktets topareal (figur 2(c) og 2(d)). Tilstedeværelsen af myresyre i kultursupernatanten er i overensstemmelse med de metaboliske produkter fra nogle alkalifile medlemmer af Bacillus-slægten og nogle saccharolytiske anaerobe alkalifile bakterier som Halonatronum saccharophilum, Amphibacillus fermentum og Amphibacillus tropicus .
Det maksimale fald i pH-enheder pr. tidsenhed, der hidtil er rapporteret for alkalifile bakterier, er 0,13 enheder pr. time for Bacillus circulans var. alkalophilus, hvilket er ret lavt sammenlignet med det fald på mere end to enheder i løbet af den første 1 times inokulering, der er rapporteret i denne undersøgelse. Det store fald i pH-værdien tyder på, at der dannes sure katabolismeprodukter. pH-sænkningens hastighed alene er imidlertid ikke et tegn på en stigning i koncentrationen af syrer. Derfor blev der foretaget en kvantitativ analyse af bakteriens metaboliske produkt ved hjælp af RP-HPLC. HPLC blev foretrukket frem for GC, da en sammenligning af GC- og HPLC-metoder til bestemmelse af organiske syrer i kultursupernatanter af alkalofile bakterier viser, at mens opløsningen af syrer ved GLC var fremragende, var den kvantitative reproducerbarhed ved HPLC bedre end ved GLC . Som forventet blev det konstateret, at koncentrationen af den producerede syre steg med stigende inkubationstid (figur 4). Faktisk fortsatte mængden af syre med at stige meget efter, at den mindste pH-værdi var nået. Dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af syreproduktion hos fakultative og obligat alkalifile Bacillus sp., hvor syreproduktionen fortsatte med at stige selv 30 timer efter, at den mindste pH-værdi var nået . Den sammenlignende analyse af det stofskifteprodukt, der blev produceret i medier suppleret med forskellige kulstofkilder, viser, at selv om syren var til stede i samme slutkoncentration, var syreproduktionen størst i medier suppleret med saccharose efterfulgt af fructose og glucose (figur 4). Dette er i overensstemmelse med organismens vækstkarakteristika i medier, der er suppleret med disse sukkerarter.
5. Konklusion
Exiguobacterium sp. stamme 12/1 neutraliserer pH-værdien i det eksterne medium ved at producere kortkædede organiske syrer – myresyre. I betragtning af den potentielle anvendelse af bioremediering af alkalisk spildevand i stor skala kan denne alkalineutraliseringskapacitet hos bakterien for drikkevareindustriens spildevand betragtes som et første skridt i retning af udnyttelse af dens kommercialiseringspotentiale.
Tilbagekaldelse
N. M. Kulshreshtha anerkender University Grants Commission for forskningsstipendium. Forfatterne er uhyre taknemmelige over for Council of Scientific and Industrial Research, Indien, for at stille en R&D-platform og faciliteter til rådighed for denne forskning.