Modafinils virkninger på adfærd og parametre for oxidativ skade i hjernen hos Wistar-rotter
Abstract
Virkningerne af modafinil (MD) på adfærdsmæssige og oxidative skader på protein og lipid i hjernen hos rotter blev evalueret. Wistar-rotter fik en enkelt administration ved gavage af vand eller MD (75, 150 eller 300 mg/kg). Adfærdsparametre blev evalueret i et åbent felt-apparat 1, 2 og 3 timer efter lægemiddeladministrationen. Thiobarbiturinsyre-reaktive stoffer (TBARS) og proteinkarbonyldannelse blev målt i hjernen. MD øgede den lokomotoriske aktivitet ved den højeste dosis 1 og 3 timer efter administration. MD-administration i en dosis på 300 mg/kg øgede besøgene i centrum af det åbne felt 1 time efter administrationen; 3 timer efter administrationen øgede alle administrerede MD-doser imidlertid besøgene i centrum af det åbne felt. MD 300 mg/kg øgede lipidskaderne i amygdala, hippocampus og striatum. Desuden øgede MD proteinskaderne i den præfrontale cortex, amygdala og hippocampus; denne virkning varierer dog afhængigt af den indgivne dosis. Derimod mindskede indgift af MD 75 og 300 mg/kg proteinskaderne i striatum ved indgift af MD 75 og 300 mg/kg. Denne undersøgelse viste, at MD-administration inducerer adfærdsændringer, som var afhængig af den anvendte dosis. Desuden syntes virkningerne af MD på oxidative skadesparametre at være i specifikke hjerneområder og doser.
1. Introduktion
Modafinil (MD) er et ikke-amfetaminergisk psykoaktivt lægemiddel, der ofte ordineres til behandling af søvn, såsom narkolepsi, obstruktivt søvnapnø-syndrom og søvnforstyrrelse ved skifteholdsarbejde . Desuden er det velbeskrevet i litteraturen, at MD forbedrer funktionen i en række kognitive domæner samt arbejdshukommelse og episodisk hukommelse . Disse virkninger af MD på hukommelsen er også blevet beskrevet hos psykiatriske patienter, hvilket tyder på, at dette lægemiddel er et fremragende kandidatmiddel til behandling af kognitiv dysfunktion i forbindelse med psykiatriske lidelser . Desuden har klinisk forskning vist, at MD forbedrer symptomerne hos patienter med svær depression, bipolar lidelse, skizofreni og opmærksomhedsunderskud/hyperaktivitetsforstyrrelse (ADHD) .
Mekanismen for virkningen af MD er dårligt forstået; det vides dog, at dette lægemiddel har en vigtig virkning på katekolaminer, serotonin, glutamat, gamma-amino-buttersyre, orexin og histaminsystemer i hjernen . Desuden viser undersøgelser, at MD hæmmer dopamintransporteren, hvilket øger den dopaminerge neurotransmission i vagtsomhedskredsløbene . Psykostimulerende stoffer som amfetamin, der også virker på forskellige neurotransmittersystemer, har vist sig at have en udpræget virkning på adfærd, herunder generering af frygt, angst og hyperaktivitet . MD er imidlertid mindre forbundet med bivirkninger såsom hyperaktivitet, angst, nervøsitet eller rebound-effekter end de traditionelle stimulanser .
Flere undersøgelser tyder på, at administration af psykostimulerende midler kan føre til oxidativt stress i rottehjernen. Hjernen er særlig sårbar over for produktion af reaktive oxygenarter (ROS), fordi den metaboliserer 20% af kroppens samlede iltindhold og har en begrænset mængde antioxidantkapacitet . Kronisk indgift af psykostimulerende stoffer som methylphenidat, m-amfetamin og d-amfetamin i rotter inducerede øget superoxidproduktion, oxidativ skade på protein, lipid og DNA og ændringer i enzymer antioxidanter og de mitokondrielle respiratoriske kædekomplekser .
Derfor var formålet med nærværende undersøgelse at evaluere virkningen af MD på adfærd og oxidative stressparametre i hippocampus, præfrontal cortex, amygdala og striatum hos rotter.
2. Eksperimentelle metoder
2.1. Dyr
Forsøgspersonerne var voksne Wistar-rottehanner (vægt 250-350 g) fra vores avlskoloni. Dyrene blev anbragt som fem i et bur med mad og vand til rådighed ad libitum og blev holdt på en 12 timers lys/mørkecyklus (lys tændt kl. 7:00 om morgenen) ved en temperatur på °C. Alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med godkendelsen fra den lokale etiske komité for brug af dyr ved Universidade do Extremo Sul Catarinense. Alle eksperimenter blev udført på samme tidspunkt i løbet af dagen for at undgå cirkadiske variationer.
2.2. Lægemidler og farmakologiske procedurer
Den MD (Libbs Farmacêutica Ltda) blev suspenderet i køretøjet-bilen: 1% methylcellulose i vand. Opløsningerne blev tilberedt umiddelbart før brug og blev beskyttet mod lys i løbet af forsøgssessionen. Den suspenderede opløsning var under omrøring i hele injektionsperioden. Kontrolgruppen modtog vehicle.
2.3. Forsøgsdesign
Det samlede antal rotter, der blev anvendt i dette forsøg, var 40 ( dyr pr. gruppe). Dyrene modtog en enkelt dosis MD (75, 100 eller 300 mg/kg kropsvægt) i et volumen på 1 ml/kg, administreret ved gavage. Kontrolgruppen fik en mængde på 1 mL/kg af et middel. Den lokomotoriske aktivitet blev målt 1, 2 og 3 timer efter injektionen, og rotterne blev aflivet ved halshugning umiddelbart efter opgaven i åbent felt.
2.4. Lokomotorisk aktivitet
Lokomotorisk aktivitet blev vurderet ved hjælp af open-field-opgaven som tidligere beskrevet . Denne opgave blev udført i et 40 × 60 cm åbent felt omgivet af 50 cm høje vægge, fremstillet af brunt krydsfiner, hvor gulvet var opdelt i 9 lige store firkanter med sorte linjer. Dyrene blev forsigtigt placeret på det venstre bageste rektangel og fik lov til frit at udforske arenaen i 5 minutter. I testen i det åbne felt blev følgende adfærdsparametre vurderet.
Krydsninger (lokomotorisk aktivitet/horisontal aktivitet): Det samlede antal firkanter, som rotterne krydsede i hele testperioden, blev talt.
Rygninger (udforskende aktivitet/vertikal aktivitet): Rattenes samlede oprejste kropsholdning i hele testperioden blev talt.
Besøg i midten af det åbne felt: Det samlede antal besøg i midten af det åbne felt blev talt. Et centerkvadrat på cm blev defineret som feltets “center”-område.
2.5. Måling af oxidative skadesmarkører
Rotter blev behandlet med MD eller vand som beskrevet ovenfor og blev aflivet ved halshugning 3 timer efter den sidste injektion, og deres hjerner blev fjernet og dissekeret med henblik på evaluering af oxidative skadesniveauer i den præfrontale cortex, amygdala, hippocampus og striatum. TBARS og proteinkarbonyldannelser blev målt som tidligere beskrevet .
2.6. Thiobarbiturinsyre-reaktive stoffer (TBARS)
Dannelsen af TBARS under en syreopvarmningsreaktion blev målt som et indeks for ROS-produktion, som er bredt vedtaget som en følsom metode til måling af lipidperoxidation, som tidligere beskrevet . Kort fortalt blev prøverne blandet med 1 mL trichloreddikesyre 10% (TCA) og 1 mL thiobarbiturinsyre 0,67% (TBA) og derefter opvarmet i et kogende vandbad i 15 minutter. TBARS blev bestemt ved absorbans ved 535 nm. Resultaterne er udtrykt som MDA (malondialdehyd)-ækvivalenter (nmol/mg protein).
2.7. Måling af proteinkarbonyler
Den oxidative skade på proteiner blev vurderet ved bestemmelse af carbonylgrupper baseret på reaktion med dinitrophenylhydrazin (DNPH) som tidligere beskrevet . Kort fortalt blev proteinerne udfældet ved tilsætning af 20% trichloreddikesyre og genopløst i DNPH, hvorefter absorbansen blev aflæst ved 370 nm.
2,8. Statistisk analyse
Alle analyser blev udført med den statistiske pakke for samfundsvidenskab version 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Alle data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. Forskelle mellem grupper i adfærdsanalyser blev verificeret ved hjælp af variansanalyse med gentagne foranstaltninger for at få adgang til tidsresponskurven, efterfulgt af Tukey’s post hoc-test. For at teste forskelle mellem grupper i biokemisk analyse anvendte vi ANOVA, efterfulgt af Tukey’s post hoc-tests. I alle eksperimenter blev værdier < 0,05 anset for at indikere statistisk signifikans.
3. Resultater
3.1. Adfærdsanalyse
For analysen af lokomotion (krydsninger) (figur 1(a)) afslørede variansanalysen med gentagne foranstaltninger signifikante forskelle for MD-administration (F(3.35) = 7.91, ) og for adfærdsgennemgangene (F(2.7) = 54.82, ). Yderligere analyse med Tukey’s post hoc-test viste, at MD på 300 mg/kg øgede rotternes spontane lokomotion sammenlignet med kontrolgruppen 1 time efter administrationen. Desuden udviste kontrolgruppen, MD ved 75 mg/kg og MD ved 150 mg/kg et reduceret antal krydsninger, da de 3 timer senere blev genudsat for det åbne felt, hvilket indikerer tilvænning til miljøet. MD med 300 mg/kg behandlede rotter viste imidlertid et reduceret antal krydsninger, når de blev genudsat 2 og 3 timer senere for det åbne felt. Denne forskel kan forklares ved den motoriske hyperaktivitet, der blev fremkaldt 1 time efter MD-administration i en dosis på 300 mg/kg.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
For analysen af udforskning (rearings) (figur 1(b)) viste variansanalysen af gentagne foranstaltninger signifikante forskelle for adfærdsgennemgangene (F(2,7) = 32,7, ). Yderligere analyse med Tukey’s post hoc-test viste, at kontrolgruppen, MD ved 75 mg/kg og MD ved 150 mg/kg udviste et reduceret antal rearings, når de 3 timer senere blev genudsat til det åbne felt. MD ved 300 mg/kg mindskede antallet af bagudvendinger, når de blev genudsat 2 og 3 timer senere for det åbne felt.
For analysen af besøg i midten af det åbne felt (figur 1(c)) viste variansanalysen med gentagne foranstaltninger signifikante forskelle for MD-administration (F(3,34) = 15,70, ). Yderligere analyse med Tukey’s post hoc-test viste, at MD på 300 mg/kg øgede besøgene til centrum af det åbne felt sammenlignet med kontrol 1 time efter administrationen. Desuden øgede MD ved alle administrerede doser besøgene i midten af det åbne felt 3 timer efter administrationen.
3.2. Biokemisk analyse
Som vist i figur 2(a) var TBARS-niveauerne signifikant forhøjet i amygdala (F(3) = 4,18, ), hippocampus (F(3) = 44,9, ) og striatum (F(3) = 7,07, ) hos rotter behandlet med MD på 300 mg/kg sammenlignet med kontrolgruppen.
(a)
(b)
(a)
(b)
Som det fremgår af figur 2(b), blev der efter administration af MD påvist en signifikant stigning i karbonylgenerering i den præfrontale cortex (F(3) = 29,9, ) ved dosis på 300 mg/kg og i amygdala (F(3) = 9,74, ) og hippocampus (F(3) = 17,99, ) ved 75 mg/kg. Omvendt reducerede behandling med MD ved 75 og 300 mg/kg signifikant karbonylgenerering i striatum (F(3) = 21,93, ) sammenlignet med kontrolgruppen.
4. Diskussion
I den foreliggende undersøgelse observerede vi, at en enkelt injektion af MD i en høj dosis (300 mg/kg) inducerer hyperlocomotion hos rotter, som ikke forbliver 2 og 3 timer efter administrationen. Ifølge vores resultater øgede MD signifikant den lokomotoriske aktivitet og øgede striatal ekstracellulære dopaminniveauer hos rhesusaber . Young og kolleger viste, at MD øgede aktiviteten, opvæksten og glatheden af lokomotoriske baner hos C57BL/6J- og 129/SJ-mus. Disse adfærdsmæssige MD-inducerede ændringer var relateret til øget synaptisk dopamin og sekundære handlinger formidlet af dopamin drd1- og drd4-receptorer. I modsætning til ovenstående undersøgelse observerer vi, selv om der er en tendens, ikke en signifikant stigning i den udforskende adfærd efter MD-administration, selv om der er en tendens. Denne uoverensstemmelse kan forklares med forskelle i metodologi, art og behandlingstidspunkt.
Her observerede vi, at kontrolgruppen og MD i lave doser (75 og 150 mg/kg) reducerede antallet af krydsninger og bagudvendinger, når de 3 timer senere blev genudsat i det åbne felt, hvilket indikerer tilvænning til omgivelserne. MD i høj dosis (300 mg/kg) reducerede antallet af krydsninger og opførsler, når de blev genudsat 2 og 3 timer senere i det åbne område. Denne uoverensstemmelse kan forklares ved, at 1 time efter indgift af MD (300 mg/kg) øgede antallet af krydsninger betydeligt, og at der var en tendens til at øge antallet af opførsler. Habituation til et nyt miljø menes at være en af de mest elementære former for ikkeassociativ indlæring. Den gentagne eksponering for det samme miljø inducerer en reduktion i den udforskende adfærd, som kan tages som et indeks for tilvænning .
Et interessant resultat af den aktuelle undersøgelse var, at MD modulerede angstrelateret adfærd. I testen i det åbne felt var MD-behandlede rotter mindre ængstelige og havde endda en tendens til at udforske det aversive centerområde mere end kontrollerne. MD på 300 mg/kg øgede antallet af besøg i centrum af det åbne felt 1 time efter administrationen. Desuden øgede MD i alle administrerede doser besøgene i midten af det åbne felt 3 timer efter administrationen. I litteraturen er undersøgelserne kontroversielle med hensyn til MD’s virkning på angst. Prækliniske undersøgelser har enten ikke vist nogen virkninger af modafinil på angst eller en anxiolytisk virkning . På samme måde viser MD i de kliniske undersøgelser enten en anxiolytisk virkning eller ingen virkning på angst , mens andre viser en anxiogen virkning . Denne forskel mellem undersøgelserne kan forklares ved variation i de anvendte doser (100 mg, 200 mg eller 400 mg) og i doseringsskemaet (engangsdosering i forhold til kronisk dosering over en uge eller mere). De anxiolytisk-lignende virkninger af MD kan forklares ved dets virkninger på amygdala, som er et hjerneområde, der er impliceret i angst, til truende stimuli. En tidligere undersøgelse viste, at MD mindsker amygdala-reaktiviteten over for frygtindgydende stimuli . Det er kendt, at amygdala er rig på katekolaminerge og serotoninerge projektioner , og så reducerer MD sandsynligvis amygdala-reaktivitet ved ændringer i intra-amygdala-signalering som følge af ændringer i noradrenalin-, dopamin-, serotonin- eller GABA-systemer eller fra en kombination af disse virkninger.
Ud over at inducere adfærdsændringer er det velbeskrevet i litteraturen, at psykostimulerende midler forårsager oxidativ skade i både dyremodeller og mennesker. Vores resultater viser, at MD øger oxidative skader på lipid og protein i hjernen hos rotter. TBARS-niveauerne blev forøget i amygdala, hippocampus og striatum hos rotter, der blev behandlet med MD i høj dosis (300 mg/kg). Desuden observerede vi en stigning i carbonylgenerering efter indgift af MD i den præfrontale cortex ved dosis på 300 mg/kg og i amygdala og hippocampus ved 75 mg/kg. Undersøgelser viser, at MD hæmmer dopamintransporteren, hvilket øger den dopaminerge neurotransmission . Den stigning i den ekstracellulære dopaminkoncentration, der induceres af MD, kan fremkalde overproduktion af den giftige metabolit dopaminoxidation , hvilket fører til oxidativ skade på proteiner og lipider i hjernen hos rotter. I litteraturen er der ingen undersøgelser, der vurderer hjerneskade efter administration af MD; disse undersøgelser er imidlertid meget vigtige, da tilgængeligheden af MD, såsom alarmberedskabsstimulerende, hukommelsesfremmende og antimotionsmiddel, for raske mennesker er stigende .
Omvendt reducerede behandling med MD (75 og 300 mg/kg) carbonylgenerering i striatum sammenlignet med kontrolgruppen. Nogle undersøgelser har vist det striatal neuroprotektive potentiale af MD. Tidligere undersøgelser viser forbedring af overlevelsen af 1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-forgiftede dopaminerge neuroner i striatum efter MD-behandling i dyremodel af Parkinsons sygdom . Raineri og kolleger har vist, at MD-administration dæmpede methamfetamin-induceret neurotoksicitet i striatum hos mus, hvilket tyder på en mulig beskyttende rolle af MD i denne hjerne region. MD har vist sig at forbedre indlæring hos methamfetaminafhængige patienter . De resultater, der præsenteres her, tyder på, at MD-administration kan udvise antioxidante egenskaber i striatum; MD’s beskyttende virkning på striatum er dog stadig ukendt. Striatum integrerer glutamatergiske input fra cortex og thalamus med dopaminerge afferenter fra mellemhjernen . Dopamin-signalering spiller en fremtrædende rolle i striatal afhængig indlæring og i synaptisk plasticitet i de mellemstjernede projektionsneuroner . Rossato og kolleger viste, at infusion af D1-receptoragonisten øgede niveauet af hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF) og dermed den synaptiske plasticitet. MD kan således fremme synaptisk plasticitet ved at aktivere det dopaminerge system og dermed beskytte striatum mod oxidativ skade.
Sammenfattende kan vi påvise, at (1) MD inducerer hyperaktivitet ved høj dosis (300 mg/kg) 1 h efter administration, som ikke forbliver 2 og 3 timer efter administrationen. (2) MD viste anxiolytiske virkninger hos rotter, hvilket øger antallet af besøg i midten af det åbne felt. (3) MD inducerede oxidativ skade på lipid og protein i rottehjernen; den oxidative skade afhænger imidlertid af den analyserede hjerne region og dosis af MD administreret. (4) Endelig kunne MD beskytte striatum mod oxidativ skade på protein mod oxidativ skade. Der skal udvises forsigtighed ved fortolkning af resultaterne. For det første blev antioxidantforsvaret ikke målt; da dette er den første undersøgelse, der undersøger virkningen af MD på oxidativt stress, erkender vi, at det kunne have hjulpet med at fortolke resultaterne. Men for det andet blev MD administreret til raske rotter; virkningerne af MD på den oxidative skade i dyremodeller af psykisk sygdom kan vise andre resultater.
Interessekonflikter
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter i forbindelse med offentliggørelsen af denne artikel.
Anerkendelser
Laboratorium for neurovidenskab (Brasilien) er et af centrene i det nationale institut for translationel medicin (INCT-TM) og et af medlemmerne af Center of Excellence in Applied Neurosciences of Santa Catarina (NENASC). Denne forskning blev støttet af bevillinger fra CNPq, FAPESC, Instituto Cérebro e Mente og UNESC. João Quevedo er CNPq Research Fellow og Roger B. Varela, Wilson R. Resende og Amanda V. Steckert er indehavere af et CAPES-studielegat; Samira S. Valvassori er indehaver af et CNPq-studielegat.