I mennesker passerer der ca. 5 til 8 liter luft ind og ud af lungerne i minuttet i hvile. Luften kan variere i ilt- og CO2-koncentration, kan indeholde allergener og giver forskellige grader af mekanisk strækning af luftvejene og gasudvekslingsfladerne. Disse signaler registreres, videresendes og bearbejdes til fysiologiske output som f.eks. kontrol af lungeblodtryk, immunreaktioner og åndedrætsrytme, men mekanismen er uklar. Pulmonale neuroendokrine celler (PNEC’er) findes i en lang række organismer fra fisk til pattedyr (1). I pattedyrs lunge er PNEC’er de eneste innerverede epithelceller i luftvejene og udgør mindre end 1 % af den samlede epithelcellepopulation i lungerne (2). Selv om der in vitro er beviser for, at PNEC’er er involveret i iltsansning, bronkial- og vaskulær glat muskeltonus og immunreaktioner (1, 3), er disse roller ikke blevet påvist in vivo. En nylig undersøgelse viste, at genetisk ablation af PNEC’er hos voksne ikke kompromitterede homeostase eller reparation af luftvejene, hvilket sætter spørgsmålstegn ved disse cellers betydning in vivo (4). PNEC-patologier, navnlig en stigning i antallet af PNEC’er, er blevet dokumenteret i en lang række lungesygdomme, herunder astma, bronchopulmonal dysplasi, cystisk fibrose, kronisk obstruktiv lungesygdom, medfødt diafragmatisk brok, neuroendokrin hyperplasi i barndommen, pludselig spædbarnsdød og pulmonal hypertension (5-8). I hvert enkelt tilfælde er det fortsat uklart, om PNEC-forøgelsen er en årsag til eller en konsekvens af symptomerne.

I muselunger befinder de fleste PNEC’er sig i klynger af ~3 til 20 celler kaldet neuroepithelial bodies (NEB’er) (3, 9). Både solitære og klyngeformede PNEC’er indeholder tætte kernevesikler, der er fyldt med bioaktive neuropeptider såsom calcitonin-genrelateret peptid (CGRP) eller aminer såsom serotonin (1). Disse frigives som reaktion på stimuli, f.eks. ændringer i iltniveauet. Neuropeptider og aminer er blevet inddraget i nogle af de samme processer som PNEC’er (10-12), hvilket giver mulighed for, at de kan formidle PNEC-funktionen. En årsagssammenhæng er imidlertid ikke blevet påvist in vivo.

Vi indledte den aktuelle undersøgelse for at afdække de mekanismer, der ligger til grund for medfødt diafragmatisk brok (CDH), en fødselsdefekt, der er forbundet med betydelig lungedysfunktion, herunder forhøjet immunforsvar og pulmonal hypertension (13). I en genetisk musemodel af CDH afdækkede vi en defekt ved manglende PNEC-gruppering. Dette efterfølges af en række begivenheder: en stigning i PNEC-neuropeptider, en stigning i immuninfiltrater og en remodellering af lungestrukturen. Disse resultater giver en in vivo demonstration af PNEC-funktionen. Da ændringer i antallet af PNEC og de tilknyttede neuropeptider er blevet dokumenteret i mange lungesygdomme, har vores resultater brede implikationer ud over CDH.

I mennesker er mutationer i roundabout receptor (ROBO)-gener blevet associeret med CDH (13, 14). For at undersøge de lungedefekter, der er forbundet med CDH, inaktiverede vi både Robo1 og Robo2 i endoderm-afledt epithel, herunder lungen, ved hjælp af Shhcre (herefter Shhcre;Robo mutant) i mus (15, 16). Selv om disse mutanter overlever, udviser de reduceret gasudvekslingsoverfladeareal begyndende ved postnatal dag (P) 15 (Fig. 1, A og B, og fig. S1). Vi udførte mikroarray efterfulgt af kvantitativ omvendt transkriptase-polymerasekædereaktion (qRT-PCR) ved P7, før reduktionen af gasudvekslingsoverflade. Femten af de 20 øverste differentielt udtrykte gener er blevet impliceret i immunreaktioner, og alle er signifikant forøgede, herunder Ccl3, Cxcl2, Tnfa og Saa3 (Fig. 1C). I overensstemmelse med denne signatur observerede vi forhøjede antal immunceller, herunder neutrofile, eosinofile, makrofager og T-celler (Fig. 1, D og E, og fig. S2). Desuden er der en stigning i andelen af M2-makrofager og et fald i andelen af M1-makrofager (fig. S3). Disse fund indikerer, at Shhcre;Robo-mutanter viser forhøjet immunfølsomhed, hvilket efterligner en almindelig CDH-komorbiditet (13).

Selv om Robo udtrykkes i den alveolære region af lungemesenchymet (fig. S4), er dens udtryk i epitelet begrænset til sjældne celler langs luftvejene (fig. 1F). Kolmærkning med CGRP-antistof viste, at Robo-udtrykkende epitelceller er PNEC’er (Fig. 1G). For at bekræfte, at Robo-gener er nødvendige inden for PNEC’er for funktion, inaktiverede vi Robo ved hjælp af Ascl1creERT2 (17), en knock-in cre-driver, der giver PNEC-specifik aktivitet i lungeepitelet (fig. S5). Vi fandt, at Ascl1creERT2;Robo-mutanter udviste både alveolær forenkling og makrofagforøgelse, hvilket rekapitulerede Shhcre;Robo-fænotyperne (fig. S6). Disse resultater viser tilsammen, at Robo er påkrævet specifikt i PNEC’er for at begrænse antallet af immunceller og forhindre alveolær forenkling.

På embryonaldag (E) 13,5 var nyspecificerede PNEC’er solitære celler i både kontrol- og Shhcre;Robo-mutantlunger (Fig. 2, A og B). Ved E15.5 havde et flertal af PNEC’erne aggregeret sig til NEB’er i kontrol. PNEC’erne var imidlertid ikke grupperet i Shhcre;Robo-mutanter (fig. 2, C og D). Denne meget gennemtrængende fænotype var vedvarende i postnatale lunger (Fig. 2, E og F, og fig. S7). Det samlede PNEC-celleantal synes upåvirket, hvilket understøttes af normal ekspression af Ascl1 og andre PNEC-markører (fig. S8). Ikke-grupperede celler i mutanten mister deres kileform og er mere afrundede (fig. S7 og S9). I modsætning til kontroller, hvor solitære PNEC’er ikke er innerveret (9), er ~33,3 % (31 ud af 93 celler) af de ikke-klumpede PNEC’er desuden innerveret i mutanten (fig. 2F og fig. S9), hvilket tyder på, at PNEC-innervation ikke er afhængig af klyngedannelse eller af Robo-funktionen i PNEC’er.

Ascl1creERT2;Robo-mutanter udviser også PNEC-unclustering (fig. S10). Denne fænotype manifesterede sig selv, når Robo-inaktivering blev induceret postnatalt, hvilket er efterfølgende til NEB-dannelsen. Tilsammen fastslår vores resultater, at Robo er påkrævet for PNEC-sammensætning og vedligeholdelse i NEB’er.

Robo kan fungere enten afhængigt eller uafhængigt af sin ligand, Slit (18). Analyse af Slit-mutanter viser, at mens PNEC-gruppering ikke er påvirket i nogen af de enkelte mutanter, er den reduceret i Slit1;3-mutanter (fig. S11, A til D). Dette resultat tyder på, at Robo-funktionen i denne proces sandsynligvis er ligandafhængig.

Slit og Robo fungerer primært til at formidle cellulær repulsion og sjældent tiltrækning (19). For at afgøre, om Slit fungerer som et frastødende eller tiltrækkende signal for Robo-udtrykkende PNEC’er, bestemte vi først, hvor Slit-generne udtrykkes. Kombineret Slit1;2-GFP (grøn fluorescerende protein)-reporter afslørede ekspression i kun omkring 1 til 3 PNEC’er inden for store NEB’er, hvilket giver mulighed for, at de Slit1/2-eksprimerende celler kan være kernecellerne i klyngen (fig. S11E). Dette indikerer også PNEC-subspecialisering inden for en klynge. Slit3-ekspression er begrænset til det vaskulære glatmuskelcellelag omkring arterier, som løber langs hovedbronkierne, hvor de fleste NEB’er findes (fig. S11, F og G). Tilsammen gav den tætte nærhed af Slit-eksprimerende celler til Robo-eksprimerende PNEC’er anledning til den mulighed, at Slit-ligander kan udgøre et attraktivt cue for PNEC’er.

For at teste dette blev flowcytometrisk sorterede GAD1-GFP+ PNEC’er udsået i det øverste kammer af en Boyden-cellemigrationskulturindsats. Når Slit-protein blev tilsat sammen med cellerne i det øverste kammer, migrerede ~52 % færre (P = 8,5 × 10-4) PNEC’er til bunden (fig. S12, J til I). Omvendt, når Slit-protein blev tilsat til bundkammeret, migrerede 18 % flere (P = 7,5 × 10-5) PNEC’er til bunden (fig. S11, L til N). Disse resultater tyder på, at Slit-Robo driver PNEC-gruppering i NEB’er, sandsynligvis gennem cellulær tiltrækning.

For at teste en mulig forbindelse mellem PNEC’er og immunrespons, testede vi ekspressionen af neuropeptider produceret af PNEC’er (1). Af de ni neuropeptidgener, der blev analyseret, blev fem signifikant opreguleret i Shhcre;Robo mutanter (Fig. 3A). Farvning med antistof mod CGRP afslørede, at selv om dets ekspression forbliver i PNEC’er i mutanten, er farvningsintensiteten øget, og den er ikke længere begrænset til den basale side af disse celler (fig. S7 og S9). Vi bemærker også, at mens unclustering skete ved E15.5, observeres neuropeptidopregulering kun efter fødslen, formodentlig ved eksponering for luft (fig. S12).

For at bestemme, om stigningen i neuropeptider bidrager til immunresponset, fokuserede vi på CGRP, fordi dets transkript viser den største stigning blandt alle analyserede (fig. 3A). Vi modvirkede denne stigning ved at avle en mutantallel af Cgrp i Shhcre;Robo-baggrunden (20). I Robo-kontroller ændrede tab af Cgrp ikke antallet af makrofager (Fig. 3, B, D og F). I Shhcre;Robo-mutanterne reducerede tab af Cgrp imidlertid markant antallet af makrofager på en dosisafhængig måde (fig. 3, C, E og F). Vi fandt også, at tab af Cgrp delvist vendte den alveolære forenklingsfænotype om (fig. S13). Vi bemærker, at hverken makrofagforøgelse eller alveolær forenkling blev helt forhindret, hvilket tyder på, at stigningen i andre neuropeptider kan bidrage til nedstrømsresultater. Tilsammen giver disse resultater in vivo genetisk demonstration af, at neuropeptider medierer PNEC-funktionen.

Da normal alveologenese indledes ved P4 (21), tyder den sene fremkomst af alveolær forenkling ved P15 på, at forstyrrelse af alveologenese måske ikke er en primær årsag. Selv om der ikke blev observeret nogen ændring i celledød ved P10, var der en klar reduktion af elastin (fig. S14), hvilket er en mulig udløsende faktor for forenkling (22). Immunceller som f.eks. makrofager udtrykker matrixmetalloproteinaser, der nedbryder elastin (23). Desuden observeres stigningen i makrofager før forenkling (fig. S1 og S2), hvilket øger muligheden for en årsagssammenhæng. For at teste dette behandlede vi Shhcre;Robo og kontrollunger med clodronat, et hydrofilt lægemiddel, der udtømmer makrofager (24). Behandlingen, der startede ved P5, før immuncelleforøgelsen, begrænsede effektivt antallet af alveolære makrofager til baseline-niveauet i Shhcre;Robo-mutanterne (Fig. 4, A til E). Dette dæmpede faldet i elastin og forhindrede helt forenkling (Fig. 4, F til J, og fig. S15). Tilsammen tilbyder disse data in vivo demonstration af, at øgede immuninfiltrater er ansvarlige for alveolær forenkling, og at begge er nedstrøms konsekvenser af PNEC-dysfunktion.

I denne undersøgelse præsenterer vi in vivo genetiske beviser, der viser, at PNEC’er, på trods af deres sjældenhed, har dybtgående indflydelse på postnatal lungefunktion. Selv om PNEC-defekten allerede er tydelig ved E15,5 i Shhcre;Robo-mutanten, indledes de fysiologiske resultater, der begynder med opregulering af neuropeptider, efter fødslen. Dette tyder på, at virkningen af PNEC er afhængig af lungernes eksponering for luft. Vores resultater beskriver således en form for signaltransduktion, hvor PNEC’er er følsomme rheostater på luftvejsvæggen, der oversætter miljømæssige signaler ikke-celleautonomt til immunreaktioner.

Vores resultater etablerer Robo1,2 som et sæt gener, der kontrollerer PNEC-gruppering i NEB’er. Det præsenterer også Slit og Robo som aktører i selektiv cellesortering i epithelet i et pattedyrsorgan. Inaktivering af Robo efter dannelse af NEB’er førte også til fjernelse af klynger, hvilket tyder på, at klyngerne opretholdes aktivt. Selv om Slit-Robo i vid udstrækning er kendt for at formidle cellulær frastødning, tyder vores data på, at de driver PNEC-gruppering gennem cellulær tiltrækning. Robo-inaktivering førte til ændret innervation og tab af basalbiaseret lokalisering af neuropeptider. Disse ændringer kan ligge til grund for den ændrede nedstrømsvirkning af PNEC’er.

En stigning i antallet af PNEC’er er blevet dokumenteret i en lang række lungeassocierede sygdomme, lige fra sjældne lidelser som CDH til almindelige tilstande som astma (5-8). Vi bemærker, at Robo-mutantens PNEC-fænotype er forskellig fra det øgede PNEC-antal. Begge er imidlertid forbundet med øgede neuropeptider, som vi viser, at de er potente effektorer af PNEC-funktionen. Vores resultater forudsiger således, at de dokumenterede PNEC-patologier og neuropeptidforøgelser snarere end at være en passiv aflæsning af sygdommen kan fungere som aktive bidragsydere til symptomer i en lang række luftvejssygdomme.