Generering af knockout-mus

Teknologier, der anvendes til at generere knockout-mus, omfatter homolog rekombination (eller gene targeting) og genfældefangst. Begge metoder indebærer anvendelse af embryonale stamceller (ES-celler) fra mus, som isoleres fra musebryoner ca. fire dage efter befrugtning. Ved den første metode, homolog rekombination, introduceres kunstigt DNA med flankerende sekvenser, der er homologe (identiske) med dem, der forekommer opstrøms og nedstrøms for målgenets DNA-sekvens, i kernen af en ES-celle fra mus. ES-cellen genkender de homologe flankerende sekvenser og udskifter det eksisterende målgen-DNA med segmenter af det fremmede DNA. Det fremmede DNA er imidlertid inaktivt. Ved at inkorporere det i ES-cellens genom inaktiveres eller slås målgenet således ud. Det fremmede DNA er typisk konstrueret til at bære et reportergen, som markerer eller mærker placeringen af det eksisterende gen, så forskerne kan spore dets tilstedeværelse i musecellens genom, efterhånden som cellerne formerer sig. Homolog rekombination er den foretrukne metode, når det kræves, at en bestemt allel (gen) erstattes af en manipuleret DNA-sekvens uden at påvirke andre gener i genomet.

Gene trapping gør også brug af kunstigt DNA, der bærer et reportergen. Men i stedet for at ramme et specifikt gen, inkorporeres det fremmede DNA tilfældigt i et hvilket som helst gen i musens ES-cellegenom. Den fremmede sekvens forhindrer det forstyrrede gen i at kode for sine proteinprodukter og gør derved genet inaktivt. Aktivering af reportergenet ved inkorporering i ES-cellens genom gør det muligt for forskerne at spore genaktivitet og udlede det forstyrrede gens funktion.

Kunstige DNA-sekvenser indføres typisk i ES-celler af mus ved hjælp af et retrovirus eller en anden viral vektor, og de modificerede ES-celler dyrkes derefter i cellekulturer. Efter nogle få dage injiceres cellerne i tidlige museembryoner, som efterfølgende implanteres i livmoderen hos en surrogathun, hvor de i sidste ende udvikler sig og bæres til termin. De musekuld, der fødes på denne måde, indeholder både modificeret og ikke-modificeret væv og er således ikke fuldstændige knockout-mus. For at frembringe et par ægte knockout-mus (homologe knockouts) skal musene avles over flere generationer. I første omgang krydses dyrene med andre mus for at frembringe heterozygote individer (mus med én kopi af målgenet); heterozygote dyr krydses derefter med hinanden for at frembringe homozygoter.