mecA gen PCR

Et 188-bp fragment inden for mecA genet og et 178-bp fragment inden for S. aureus-specifikke Sa442-gen blev amplificeret for isolat 1 og 2 i separate reaktioner på en LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland) ved hjælp af SYBR-grønt med henholdsvis primere Mec-S og Mec-A eller Sa442-F og Sa442-RS som tidligere beskrevet (5). mecA-positive isolater genererer SYBR-grønne smeltetemperaturer på 79 °C. Sa442-positive isolater genererer også en SYBR-grøn smeltetemperatur på 79 °C. S. aureus ATCC 29213 (modtagelig for oxacillin) og S. aureus ATCC 43300 (oxacillinresistent) blev anvendt som kontrol for Sa442-genet og som henholdsvis negativ og positiv kontrol for mecA-genet. I modsætning til kontrollerne blev der ikke dannet noget mecA- eller Sa442-produkt for isolat 1 og 2. Der blev udført en yderligere PCR for at påvise et større 533-bp-fragment af mecA-genet (4). Der blev ikke dannet noget produkt i isolat 1 og 2 eller S. aureus ATCC 29213, men der blev dannet et produkt af den forventede størrelse fra S. aureus ATCC 43300. 16S rRNA-genet, der blev anvendt som positiv kontrol, blev amplificeret fra alle stammer (data ikke vist).

En nøjagtig og rettidig påvisning af methicillinresistens hos S. aureus er en vigtig funktion for det kliniske mikrobiologiske laboratorium (20). Mens påvisning af mecA-genet ved PCR er guldstandarden, har PBP2a-latex-agglutinationstesten vist sig at være en enkel og hurtig test med gode præstationsegenskaber til påvisning af methicillinresistens hos både S. aureus og koagulase-negative stafylokokarter, uanset at der i nogle tilfælde er behov for forudgående induktion (1, 21). PBP2a-assayet anvender latexpartikler, der er sensibiliseret med monoklonale antistoffer, der er rejst mod PBP2a (11). Specificiteten af denne test nærmer sig efter sigende 100 % (18, 19). Selv om der ikke foreligger nogen rapporter om PBP2a-latex-agglutinationstests for S. intermedius-isolater, er der konstateret falsk-positive PBP2a-resultater med to S. warneri-isolater, det ene efter 1 min og det andet efter 6 min, som begge var mecA-PCR-negative med en oxacillin-MIC på ≤0,5 μg/ml (21). Ifølge producentens indlægsseddel er falsk-positive reaktioner generelt svage agglutineringer, som ofte er negative ved gentagelse af testen med en frisk kultur. Vi fandt imidlertid, at vores to isolater var gentagne gange positive efter flere subkulturer, hvoraf den ene var stærkt positiv. S. intermedius ATCC 29663-stammen var faktisk negativ ved PBP2a-test, men var også fænotypisk forskellig fra de to kliniske stammer med hensyn til positiv mannitolfermentering, β-lactamase-negativitet og penicillinfølsomhed (resultater ikke vist).

Koagulasepositivitet anvendes almindeligvis til at tillægge isolater af Staphylococcus spp. klinisk betydning og patogenicitet. Mens S. aureus er den mest almindelige koagulasepositive stafylokokker isoleret i det kliniske laboratorium, er S. intermedius, S. delphini, S. schleiferi subsp. coagulans, S. lutrae og nogle stammer af S. hyicus også koagulasepositive (1). Laboratorierne anvender ofte en kombination af test til påvisning af fri koagulase eller klumpningsfaktor med og uden protein A til at identificere koagulasepositive stafylokokker. S. intermedius-isolater er positive for fri koagulase, men negative for protein A, og 14 % af isolaterne har en klumpningsfaktor, hvilket ville forklare den positive glidekoagulase og den svagt positive BACTi Staph latex for isolat 1 (6). Som tidligere beskrevet fandt vi, at pyrrolidonyl arylamidase-positivitet er en hurtig måde at fastslå, at en koagulase-positiv stafylokokker ikke er S. aureus (10). Vi mener, at vores tilfælde tyder på, at den reelle forekomst af S. intermedius i humane sårinfektioner sandsynligvis er undervurderet, fordi alle koagulasepositive stafylokokker ofte slås over én kam som S. aureus (17). I mangel af endelig identifikation af S. intermedius ved hjælp af fænotypiske eller biokemiske metoder har sekventering af 16S rRNA-genet vist sig at være nyttig til taksonomisk klassifikation af Staphylococcus- og Macrococcus-arter (8).

En første undersøgelse i 1989 viste, at 72 % af S. intermedius-isolaterne fra hundegiva og sårinfektioner hos hunde var modtagelige over for penicillin, og ingen var resistente over for oxacillin (16). En nyere undersøgelse viste, at oxacillinresistens er et stigende problem hos S. intermedius-isolater, idet der blev konstateret 60 til 85 % større oxacillinresistens for isolater fra næse, øjne og bylder hos hunde sammenlignet med isolater fra de andre steder (7). I den første humane infektion forårsaget af methicillinresistent S. intermedius, hvor den var årsag til lungebetændelse, var oxacillin-MIC’en 32 μg/ml (3). Begge vores isolater var resistente over for penicillin og var β-lactamasepositive; oxacillin-MIC for disse isolater var 0,125 μg/ml. Penicillinresistensen hos disse isolater kan, i mangel af oxacillinresistens med en negativ mecA PCR og følsomhed over for β-lactam/β-lactamasehæmmerkombinationer, forklares med det positive resultat af β-lactamaseassayet. Ved hjælp af primersættet, der er rettet mod et 533-bp-fragment af mecA-genet, har Gortel et al. bekræftet, at mecA-genet giver methicillinresistens hos stafylokokker isoleret fra hunde (4). Disse forskere fandt, at blandt 10 koagulasepositive stafylokokstammer, der var bærere af mecA, var 9 S. aureus og 1 S. intermedius. De antog, at forskellen i prævalensen af methicillinresistens hos S. intermedius sammenlignet med S. aureus skyldtes en forskel i mecA-reguleringen mellem arterne eller manglen på et intensivt antibiotisk selektionstryk på S. intermedius (4). Der findes ingen specifikke NCCLS-tolkningskriterier for andre koagulasepositive stafylokokker end S. aureus, men resultaterne af oxacillinfølsomhedstestning ved hjælp af fænotypiske og genotypiske metoder (mecA-gen-PCR ved hjælp af to primersæt, der er rettet mod 188- og 533-bp-fragmenter) kombineret med lave oxacillin-MIC’er sammenlignet med dem, der tidligere er rapporteret for oxacillinresistente S. intermedius-isolater (MIC > 4 μg/ml), fastslår, at isolat 1 og 2 i denne undersøgelse er oxacillinfølsomme (3, 4).

Det er velkendt, at methicillinresistens hos S. aureus hovedsagelig skyldes erhvervelse af et ekstra penicillinbindende protein, PBP2a, som er kodet af mecA-genet. En søgning efter oprindelsen af mecA-genet førte til identifikation af en mulig evolutionær forløber i S. sciuri, en kommensal hos dyr. MecA-homologen i S. sciuri viste 79,5 % DNA-sekvenslighed med mecA-genet fra S. aureus og 88 % aminosyreidentitet med PBP2a. S. sciuri mecA-homologen giver ikke resistens over for methicillin i naturen. Couto et. al. identificerede imidlertid methicillinresistente S. sciuri-isolater fra mennesker, hvor overekspression af mecA-homologen som følge af indsættelse af et IS256-element opstrøms for det strukturelle gen eller enkelt-nucleotidændringer i promotorregionen resulterede i produktion af et protein, der funktionelt ligner PBP2a (2). I lighed med S. sciuri-isolaterne kan de her beskrevne S. intermedius-isolater indeholde en mecA-homolog, der koder for et PBP2a-lignende protein, som krydsreagerer med PBP2a-latex-agglutinationstesten, men som ikke giver methicillinresistens. Antigenisk efterligning med et helt ubeslægtet protein er også mulig. I begge tilfælde håber vi at øge bevidstheden i det mikrobiologiske samfund om, at der findes kliniske isolater, som kan udfordre specificiteten af PBP2a-latex-agglutinationstesten.

Sammenfattende giver vi den første rapport om falsk-positive PBP2a-resultater for to stammer af S. intermedius, som, kombineret med en indledende fejl i fortolkningen af fænotypiske tests, førte til fejlidentifikation som MRSA. Falsk-positive PBP2a-resultater kan føre til fejlagtige forsøg på infektionsbekæmpelse, unødvendig brug af antibiotika som vancomycin og en generel stigning i hospitalsudgifterne (20). Disse tilfælde understreger vigtigheden af aktivt at forfølge diskrepante laboratorieprøveresultater for at undgå rapporteringsfejl. En nøjagtig artsidentifikation af de koagulasepositive stafylokokker er afgørende for at bestemme de kliniske isolaters patogenicitet, kliniske betydning, følsomhedsmønstre og epidemiologi.