Resultater og diskussion

Strukturerne og energierne af forskellige muterede modelsystemer af KSI er blevet undersøgt langs tre reaktionstrin: For det første, abstraktion af C4-β proton (ES → TS1 → EI1); for det andet, let rotation af protoneret Asp-40 (EI1 → TS2 → EI2); og for det tredje, proton donation til C6-β positionen af Asp-40 (EI2 → TS3 → EP), som vist i Fig. 1. Den forudsagte energiprofil for WT (fig. 2A) svarer til den tilsvarende eksperimentelle profil fra Pollack og kolleger (25). Det skal bemærkes, at substratet ved TS2 er delvist neutraliseret, da H-atomerne i de katalytiske rester nærmer sig oxyanionen (O3) i substratet, og den overskydende elektron overføres fra substratet til de tilstødende katalytiske rester gennem H-bindingssporene. Således deler substratet, Tyr-16/57 og Asp-103 én negativ ladningsenhed, og deres ladningsfordelinger afhænger af protonaffiniteterne og elektronaffiniteterne hos de katalytiske rester af mutanterne. Denne TS2-tilstand med katalytiske rester står i kontrast til tilstanden uden katalytiske rester, hvor substratet er negativt ladet med næsten én enhed.

Vores beregnede tredimensionelle strukturer af EI’er (komplekseret med equilenin i stedet for steroid) passer næsten nøjagtigt med røntgenstrukturerne af PI(g′) og TI(g′). I den forudsagte struktur af Tyr-16/57 + Asp-103 + equilenin-komplekset er de to d(O3-Or)-afstandsværdier for Tyr-16 og Asp-103 (henholdsvis 2,54 og 2,55 Å) i god overensstemmelse med røntgendataene (2,6 ± 0,1 Å for begge i tilfælde af PI og henholdsvis 2,58 ± 0,08 Å og 2,62 ± 0,07 Å i tilfælde af TI) (32, 33, 36). Da de beregnede strukturer blev optimeret uden begrænsninger, tyder overensstemmelsen i de eksperimentelle og teoretiske geometrier på, at i enzymet har nøgleresterne næsten maksimale interaktioner med substratet uden belastning.

Det er blevet formodet, at det aktive sted for TI i opløsning kan have den dyadiske struktur (Asp-99… Tyr-14… equilenin) (29), som er forskellig fra røntgenstrukturerne for TI og PI (32, 33). Et nyligt NMR-forsøg for PI/equilenin har imidlertid vist, at der i PI(D40N)/equilenin forekommer en karakteristisk stærk nedadrettet resonans ved 16,8 ppm og en svag resonans ved 13,1 ppm (36), svarende til det tilfælde i TI/equilenin, som Mildvan- (29) og Pollack-grupperne (25) har fundet for TI/equilenin. Dette resultat fremgår også af vores ab initio-beregninger af Tyr-16/57 + Asp-103 + equilenin-komplekset, hvor den stærke downfield-resonans ved 16,5 ppm er tildelt Tyr-16. Eksperimentet viser også, at der i mutanten D103L + D40N forekommer en stærk down-field resonans (tildelt Tyr-16), mens den stærke resonans forsvinder i mutanten Y16F + D40N. Dette eksperiment udelukker således klart den dyadiske struktur, hvor den stærke down-field resonans blev tildelt Asp-103, som er H-bundet til Tyr-16 (36).

De absolutte hastighedskonstanter kan undersøges ved at anvende de beregnede aktiveringsbarrierer. På B3LYP/6-31+G*- og MP2/6-31+G*-niveauerne er aktiveringsbarrieren for WT af KSI noget undervurderet sammenlignet med den eksperimentelle barriere (10 til ≈11 kcal/mol), der er rapporteret af Pollack og medarbejdere (46). Når der imidlertid tages hensyn til den dielektriske mediumeffekt af KSI (31), er aktiveringsbarrieren for WT 8,2 kcal/mol, hvilket er i tæt overensstemmelse med den eksperimentelle værdi. En lille undervurdering på 2-3 kcal/mol kunne forklares med en mere præcis beregning og et mere komplet modelsystem, der omfatter apolære rester omkring det aktive sted. I modsætning til den absolutte aktiveringsbarriere er de relative aktiveringsbarrierer mellem forskellige mutanter og dermed reaktionsmekanismen ret konsistente uanset beregningsniveauet på grund af annulleringseffekten mellem forskellige modelsystemer med lignende miljøer. Ved at anvende relative aktiveringsbarrierer mellem forskellige mutanter opnåede vi således den relative reaktivitet (forholdet mellem den kinetiske hastighedskonstant for en mutant og WT) eller log(kcat/kcat(WT)) med den antagelse, at overførslen fra ES til TS1 er det hastighedsbestemmende trin langs reaktionsvejene (se fodnoten i tabel 1). MP2-beregninger forstærker de resultater, der er opnået på B3LYP-niveau. De forudsagte værdier af log(kcat/kcat(WT)) er i god overensstemmelse med de værdier, der er målt for PI (32-35) og TI (25-28, 31) (tabel 1). Da den meget homologe tredimensionelle (tertiære og kvaternære) struktur og miljøet på det aktive sted for TI svarer til PI’s, forventes de katalytiske reaktioner i de to KSI’er at forløbe på samme måde.

Figur. 2 viser profiler af energier og H-båndsafstande for forskellige mutanter langs reaktionsvejen. De samlede energiprofiler (ΔE) (fig. 2A) er næsten symmetriske med hensyn til TS2. Barriererne for det første og tredje trin er ens. Det andet trin, som har en lille barriere (≈1 kcal/mol), kan ikke være hastighedsbestemmende, fordi det kun indebærer en lille forskydning af H-atomet gennem en minimal rotation (med kun nogle få grader, fordi Asp-40 er stærkt skråt mod substratplanet) omkring en C-C-binding (eller C-H-binding i fig. 1 og 3). Reaktionen kan således praktisk talt betragtes som en totrinsmekanisme. Resterne katalyserer det første trin ved (delvist) at afgive en proton til substratet (som en syre), mens det tredje trin katalyseres ved (delvist) at acceptere en proton fra substratet (som en base). Der henvises til H-bindingernes interoxygenafstande og den excentriske afstand af en delt proton fra O3’s og Or’s midtpunkt, hvor den positive/negative værdi angiver, at protonen befinder sig nær resterne/substratet.

For sure rester med lavere protonaffinitet (pA i gasfasen eller pKa i det dielektriske medium) ville aktiveringsbarrieren være lavere for det første trin og højere for det tredje trin, mens basiske rester med højere pA eller pKa ville give en modsatrettet effekt. I enzymmekanismen med to trin opnås den optimale katalytiske kraft derfor, når enzymresterne spiller en dobbeltrolle som meget stærk protonedonor/acceptor til/fra substratet skiftevis (der benævnes amfi-syre/base-katalysator eller proton/elektron-buffer) for den samlede reaktion. I enzymernes dielektriske medium opnås den maksimale katalytiske effekt i tilfælde af lige pKa’er for rester og substrat . Denne situation står i modsætning til enkelttrinsreaktioner, hvor en stor forskel i pKa øger reaktiviteten (47, 48). Betingelsen om lige pKas mellem rester og substrat for at opnå den maksimale katalytiske effekt svarer til kravet om, at resterne i enzymet skal have tilsvarende pKas med substratet for at danne de maksimale SSHB’er (4-7, 15, 23, 24). I KSI’s totrinsreaktionsmekanisme spiller SSHB’erne som amfi-syre/base-katalysatorer sammen med partielle proton-shuttles og ladningsomfordelinger således en afgørende rolle i den stærke stabilisering af EI’er med ≈15 kcal/mol i rest-drevet stabiliseringsenergi og i reaktionsvej-afhængig interoxygen afstandsforkortelse i forhold til ES-tilstanden .

Den rest-drevne stabiliseringsenergi ΔΔEa er til en vis grad korreleret med ΔdES, medmindre protonoverførslen sker fra rest til substratet (dvs, medmindre ΔrH er i et negativt område i fig. 2C). Derfor kan stabiliseringen ved EI’er og TS’er korreleres med forkortelsen af H-båndsafstanden og dermed H-båndsstyrken i forhold til ES-tilstanden. Det vil sige, at de normale (eller almindelige) H-bindinger (mellem neutrale partnere) ved ES har tendens til at blive til SSHB’er (der involverer ioniske arter) ved EI’er og TS2. Disse korte bindinger bør således være ansvarlige for en del af den restbetingede energisænkning. Hvad angår protonoverførslen, er potentialet ved ES en enkelt brønd for alle mutanter, mens potentialets form (nær EI’er eller TS’er) i det område, hvor ΔrH er nær nul (dvs. omkring TS1/EI1 for c og EI1/TS2 for e og f i Fig. 2C) bærer nogle karakteristika af en dobbeltbrønd. For en lille absolut værdi af ΔrH (<≈0,5 Å) (Fig. 2C) (Fig. 2C) viser det sig, at barrieren for protonoverførsel er meget lille i vores beregning, og derfor kan protonoverførslerne i potentialet af dobbeltbrønde-typen ikke alene forklare den drastiske sænkning af aktiveringsbarrieren. Faktisk viser tilfælde g, hvor potentialets dobbeltwell-lignende egenskaber næsten forsvinder med lidt protonoverførsel, en større energisænkning end tilfælde f, som indebærer protonoverførsel i et dobbeltwell-lignende potentiale. På den anden side skal det bemærkes i fig. 2 D og E, at ΔdES ikke længere forkortes, men forlænges en smule, efter at protonoverførslerne er sket, mens ΔΔEa stadig sænkes. Således kan H-bindingens længdeforkortelse alene (dvs. ΔdES) ikke forklare den drastiske barriereforringelse ved TS’er og EI’er (dvs. ΔΔEa). Barrieresænkningen ved TS’er og EI’er skal således forklares ved yderligere vekselvirkningskræfter, som vil blive diskuteret i form af molekylære orbital (MO)-interaktioner mellem substrater og rester (der involverer ladningsoverførselsinducerede elektroniske omlægninger eller ladningsomfordelinger).

I tilfælde af to konkurrerende rester som i f og g resulterer den kumulative stabilisering af EI’er/TS’er i en mere forbedret kcat. Denne effekt er imidlertid noget subadditiv (dvs. mindre end summen af stabiliseringsenergierne for hver enkelt rest) som følge af oxyanionens reducerede proton-adskillende effekt for hver enkelt rest på grund af tilstedeværelsen af den anden rest. Denne subadditivitet indikerer, at SSHB’erne ville involvere ladningsoverførsler og polarisering (dvs. inducerede elektrostatiske interaktioner) og muligvis delvis kovalente bindinger. Faktisk skyldes stabiliseringen af EI’er og TS’er i tilstedeværelsen af katalytiske rester hovedsagelig delokalisering af den overskydende elektron, der er til stede på det aktive sted, ved ladningsoverførsel og polarisering, hvilket vil blive vist nedenfor. De effektive naturlige bindingsorbitalpopulationsladninger (49) af substratet i tilfælde a, c-e og f ved TS1 er henholdsvis -0,57, ≈-0,43 og -0,37. Substratets negative ladning er således mere reduceret ved tilstedeværelsen af to katalytiske rester. Denne reduktion skyldes overførsel af den overskydende elektron fra substratet til de katalytiske rester med stor elektronaffinitet, som spiller en rolle som buffer for den overskydende elektron. Selv om Asp har en stærkere elektrontrækningskraft end Tyr, har Tyr en lavere elektronaffinitet end Asp. Tyr er således lige så effektiv som eller lidt mere effektiv end Asp med hensyn til at sænke aktiveringsbarrieren. Stabiliseringen af TS’erne og EI’erne i tilstedeværelse af katalytiske rester er i høj grad korreleret med energiforringelsen af tilstanden med overskydende elektroner , da pladsen til at rumme den overskydende elektron udvides med katalytiske rester ud over substratet. Denne energisænkning er direkte relateret til usikkerhedsprincippet; jo mindre lokaliseret overskudselektronen er, jo mere er den stabiliseret.

De beregnede kemiske forskydninger (δ) viser sig at være noget korreleret med den mindste værdi af d(O3-Or) for det samme antal H-bindinger , hvorimod tilstedeværelsen af den anden H-binding øger δ på grund af den øgede screeningseffekt. På grundlag af vores resultater kan en stor værdi af δ ofte være en god indikator for SSHB, men δ er kun delvist korreleret med kcat. Denne korrelation mindskes især for stor δ (>16 ppm) eller lille absolut værdi af ΔrH (<0,5 Å), da der er blevet sat spørgsmålstegn ved afhængigheden af kcat af δ (50).

Sænkningen af aktiveringsbarrierer i tilstedeværelsen af katalytiske rester er velforstået fra MO-analyse (Fig. 3). Den slående forskel i TS2 MO-energiniveauer mellem a og g skyldes kvantemæssig karakter af den overskydende elektrontæthed, der akkumuleres på substratet gennem deprotonering af Asp-40. Den resulterende stabilisering, der opnås ved at sprede en del af elektrontætheden til de katalytiske rester, skyldes det tidligere nævnte usikkerhedsprincip, som svarer til det, der er observeret i tilfælde af en overskydende elektron, der interagerer med vandklynger (51, 52), hvilket er til fordel for et rimeligt stort hulrum. Således reducerer tilstedeværelsen af de katalytiske rester (som spiller ladningsbufferrollen ved delvis elektronoverførsel fra substratet til de katalytiske rester) drastisk ladningsopbygningen på oxyanionen. Denne stabilisering af EI’erne og TS’erne understøttes i det væsentlige af SSHB’erne. Denne effekt er stærkt forstærket i tilstedeværelsen af både Asp-103 og Tyr-16/57. MO-energierne i tilfælde g er således meget lavere end i tilfælde a. Enzymets dielektriske mediumeffekt er ikke så drastisk som den katalytiske restvirkning, der involverer elektronoverførsel. Således er partielle protonshuttles og ladningsomfordelinger, der fremmes af SSHB’er, mere ansvarlige for sænkningen af TS’erne og EI’erne end enzymets dielektriske effekt. Den katalytiske effekt er derfor et resultat af en gunstig kombination af gevinster fra ikke-inducerede elektrostatiske energier og MO-interaktionsenergier (polarisering, ladningsoverførsel og kovalent bindingsenergi). Mens førstnævnte er et resultat af de delvise protonshuttles på grund af tilstedeværelsen af ladede H-bindinger (og dermed relateret til SSHB’ernes styrke), er sidstnævnte hovedsagelig et resultat af elektronisk delokalisering på grund af de katalytiske rester, som spiller en bufferrolle for en overskydende elektron. MO-interaktionsenergiforøgelsen er tæt forbundet med den yderligere enzym-substrat-interaktion, der fremmes af SSHB.

Stabiliseringsenergien kan således repræsenteres som summen af den øgede energi af den ladede H-binding (der involverer ioniske arter) af EI/TS’er i forhold til den normale H-binding (mellem neutrale partnere) af ES og MO-interaktionsenergiforøgelsen på grund af de ladningsomfordelinger, der involverer elektronafgivelse til de katalytiske rester. Da de to energitermer ikke er lette at adskille, er det vanskeligt at vurdere hver enkelt term. Vi vurderer dog disse termer i tilfælde d ved hjælp af følgende metode. Ud fra sammenligningen af energierne af EI1 i forhold til ES i fravær og tilstedeværelse af Tyr-16 (Y16) er stabiliseringsenergien af EI1 ved Y16 8,7 kcal/mol. For at undersøge bidraget fra den ikke-inducerede elektrostatiske interaktion (som ikke omfatter den elektrostatiske induktionseffekt af substrat + Asp-40 (D40) på rest Y16) til stabiliseringen, udførte vi beregningerne af ES og EI1 i det tilfælde, hvor Y16 er erstattet af en spøgelsesrest, der kun består af dens naturlige bindingsorbital (NBO)-ladninger (Y16q), som blev beregnet for et enkelt molekyle Y16 i fravær af substrat + D40. Derefter er den ikke-inducerede elektrostatiske interaktionsenergiforøgelse (eller præorganisationsdrevne elektrostatiske energiforøgelse) 4,4 kcal/mol, som er ansvarlig for øget bindingsstyrke af den ladede H-binding (dvs. selve SSHB). Derefter bør forskellen i stabiliseringsenergier mellem den fulde kvanteeffekt ved Y16 og den ikke-inducerede elektrostatiske effekt ved Y16q (4,3 kcal/mol) komme fra den inducerede elektrostatiske interaktionsenergi, kovalent energi osv. Den inducerede elektrostatiske vekselvirkning omfatter polarisations- og ladningsoverførselseffekter. For at opnå den inducerede elektrostatiske energiforøgelse fik vi først de atomare ladninger af Y16 (Y16qind), som omfatter induktionseffekten i nærvær af substratet + D40. Derefter udførte vi beregningerne af ES og EI1 i det tilfælde, hvor Y16 er erstattet af en spøgelsesrest (Y16qind), der kun består af dens atomare punktladninger. Da denne stabiliseringsenergi er 8,2 kcal/mol, er den inducerede elektrostatiske energiforøgelse fra vekselvirkningen mellem substrat + D40 og Y16 3,8 kcal/mol. Energitilvæksten ved ladningsoverførsel og polarisering er således stor og kan sammenlignes med den ikke-inducerede elektrostatiske energitilvækst. Residual Y16 spiller vigtige katalytiske roller som ladningsbuffer for at trække og holde en stor del af den overskydende negative ladning i substratet tilbage og for den tilsvarende elektroniske ladningsomfordeling under reaktionen. Denne inducerede elektrostatiske energi stammer fra MO-interaktionsenergien ved den kvantemekaniske elektroniske ladningsinteraktion mellem den katalytiske rest (Y16) og substratet + D40 (dvs. den SSHB-drevne substrat-residual-interaktionsenergi). Endelig kunne det resterende energibidrag på 0,5 (= 8,7-8,2) kcal/mol for det meste svare til den ikke-elektrostatiske kovalente energi. Denne energi er ret lille, hvilket yderligere bekræftes af vores MO-analyse, som viser, at den ikke-elektrostatiske orbitaloverlapning i selve SSHB ikke er signifikant.

I enzymer, der involverer en totrinsreaktionsmekanisme, er et substrat ikke fuldt negativt ladet, men er delvist anionisk med elektronafgivelse til de katalytiske rester. Således viser det sig i dette tilfælde, at den stabiliseringsenergitilvækst (≈10 kcal/mol ved EI1) drevet af SSHB i forhold til den normale H-binding ikke viser sig at være lille . Hvis SSHB-energien udvides til at omfatte substrat-rest-interaktioner som følge af ladningsomfordelinger i både substrat og rest, er det stabiliseringsenergien, der er summen af den præorganisationsdrevne SSHB-energi og den SSHB-drevne MO-interaktionsenergi. Hvis vi imidlertid kun betragter styrken af selve SSHB’en, er tilvæksten i bindingsenergien meget reduceret (til ≈5 kcal/mol).