Isoenzymer af pattedyrs hexokinase: struktur, subcellulær lokalisering og metabolisk funktion | Journal of Experimental Biology
Type I isoenzym
Som det fremgår af fig. 1, tjener hexokinase som porten, hvorigennem Glc kommer ind i alternative metaboliske veje. Ikke desto mindre er det nok sikkert at sige, at hexokinase mest almindeligvis betragtes som et glykolytisk enzym, og glykolytisk metabolisme betragtes generelt som en cytoplasmatisk proces. Det var derfor bemærkelsesværdigt, at i modsætning til andre glykolytiske enzymer blev hexokinaseaktivitet (nu kendt som type I-isoenzym) overvejende fundet i “partikulære fraktioner” af hjernehomogenater (Crane og Sols, 1953). Efterfølgende arbejde (Johnson, 1960; Rose og Warms, 1967; se også Wilson, 1995) viste, at den partikulære hexokinase var associeret med mitokondrier og mere specifikt med den ydre mitokondriemembran (Rose og Warms, 1967; Kropp og Wilson, 1970).Bindingen er kritisk afhængig af en hydrofob N-terminal sekvens (Polakis og Wilson, 1985), som selektivt målretter Type I isozymet til mitokondrier (Gelb et al, 1992; Sui og Wilson, 1997) og indsættes i den hydrofobiske kerne af den ydre mitokondriemembran i forbindelse med bindingen (Xie og Wilson, 1988). Porin (også kaldet “DVAC”, akronym for “volt-afhængig anionkanal”) danner den kanal, hvorigennem metabolitter krydser den ydre mitokondriemembran, og blev identificeret som det ydremitokondriemembranprotein, der interagerer med hexokinase (Felgner et al., 1979;Lindén et al., 1982;Fiek et al., 1982). Desuden er der beviser for, at hexokinase bindes fortrinsvis til porin, der er placeret i kontaktsteder, områder, hvor der er tæt kontakt mellem den indre og ydre mitokondriemembran (Dorbani et al., 1987; Kottke et al, 1988;BeltrandelRio og Wilson,1992a).
De klassiske undersøgelser af Johnson(1960) og af Rose og Warms(1967) blev hurtigt efterfulgt af rapporter om mitokondriebundet hexokinase fra andre normale væv, ud over hjernen, samt fra forskellige tumorceller (for referencer, se Wilson, 1985,1995). Den potentielle fysiologiske betydning af denne tilknytning af et “glycolytisk” enzym tilmitokondrier, som er det primære sted for oxidativt stofskifte, har været genstand for mange spekulationer. Fra begyndelsen og især efter erkendelsen af, at det “hexokinasebindende protein” i den ydre mitokondriemembran var identisk med porin, og at hexokinase således kunne være placeret i nærheden af det punkt, hvor ATP forlader mitokondrierne (og ADP kommer ind i dem igen), spekulationerne var i høj grad fokuseret på muligheden for, at denne nærhed kunne fremme et intimt metabolisk samspil mellem intramitokondriel oxidativ fosforylering som kilde til ATP-substrat og Glc-fosforylering af den mitokondrielt bundne hexokinase. Dette var faktisk blevet overvejet af Rose og Warms (1967), men kunne ikke underbygges af deres eksperimentelle resultater. Efterfølgende arbejde udført af andre (for referencer se igen Wilson,1985,1995) med mitokondrielt bundet hexokinase fra forskellige kilder gav imidlertid beviser for, at mitokondrielt bundet hexokinase havde “præferentiel” eller “privilegeret” adgang til intramitokondrielt produceret ATP.
Arbejdet i vores laboratorium har givet et solidt grundlag for den opfattelse, at hexokinase bundet til aktivt fosforylerende hjernemitokondrier faktisk er tæt koblet til et intramitokondrielt kompartment af substrat-ATP, der er genereret ved oxidativ fosforylering. Den eksperimentelle støtte for denne konklusion er blevet beskrevet i en række publikationer (Beltrandel Rio og Wilson, 1991,1992a,b;de Cerqueira Cesar og Wilson,1995,1998,2002;Hashimoto og Wilson,2000). En fuldstændig gennemgang af dette arbejde er ikke mulig i denne sammenhæng, men vi vil fremhæve nogle af de vigtigste resultater for at illustrere de forskellige eksperimentelle tilgange, der alle har ført til den samme konklusion, og som er blevet anvendt i disse undersøgelser.
De første undersøgelser (BeltrandelRio og Wilson,1991,1992a,b)blev foretaget ved hjælp af spektrofotometriske metoder, hvor ATP-produktion ved forskellige intramitokondrielle processer (oxidativ fosforylering, adenylatkinasereaktion, kreatinkinasereaktion) og Glc-fosforylering ved hexokinase blev forbundet med NADPH-produktion, overvåget ved 340 nm, ved hjælp af passende koblingsenzymer. Den grundlæggende idé var, at man ved at sammenligne hastigheden af Glc-fosforylering med hastigheden af ATP-produktion fra forskellige kilder kunne udlede den relative betydning af forskellige intramitokondrielle ATP-producerende processer som en kilde til substrat-ATP for hexokinase. Konklusionen var, at når der foregik oxidativ fosforylering, var hverkenadenylatkinase eller kreatinkinase en væsentlig kilde til substratATP. Desuden blev kun en brøkdel af den ATP, der blev produceret ved oxidativ fosforylering, udnyttet af hexokinase, hvilket resulterede i, at indholdet i det ekstramitokondrielle medium fortsatte med at stige, efterhånden som den oxidative fosforylering fortsatte. Glc-fosforyleringshastigheden steg ikke støt som reaktion på den fortsatte stigning i extramitokondriemediet, dog på trods af, at sidstnævnte var sammenlignelig med Km for ATP, der blev set med tilsat extramitokondrie-ATP i fravær af oxidativ fosforylering, dvs. at hexokinasen ikke ville være blevet “mættet” med extramitokondrie-ATP som substrat (Fig. 2). Dette tyder stærkt på, at det ikke var extramitokondrielt ATP, der blev brugt som substrat.
Glucose (Glc)-fosforylering til glucose-6-fosfat (Glc-6-P) afmitokondrielt bundet hexokinase med eksogen ATP eller med ATP genereret ved oxidativ fosforylering. Hastigheden af Glc-fosforylering blev bestemt ved hjælp af en ækvivalent, der enten blev tilsat eksogent i fravær af oxidativ fosforylering (trekanter) eller genereret ved oxidativ fosforylering (cirkler). Fra begge kilder var den undermættende, idet hastigheden af Glc-fosforylering var langt under den, der blev set, når ATP-niveauerne blev akut forhøjet ved tilsætning af mættende niveauer af eksogen ATP (firkanter). Genudtrykt med tilladelse fra BeltrandelRio og Wilson(1991).
Det blev yderligere understøttet af resultater som dem, der er vist iFig. 3. Her blev Glc-fosforylering overvåget efter initiering af oxidativ fosforylering ved tilsætning af ADP, med stigende koncentrationer af extramitokondriel ATP tilstede fra starten. Som forventet ud fra klassisk Michaelis-Mentenkinetik steg den indledende Glc-fosforyleringshastighed med stigende ekstramitokondriel . Med tiden blev der imidlertid opnået en stationær Glc-fosforyleringshastighed, som var uafhængig af mængden af resterende tilstedeværende ekstramitokondriel ATP. Disse resultater blev fortolket som tegn på, at mens den mitokondriebundne hexokinase oprindeligt anvendte ekstramitokondrielt ATP, førte initiering af oxidativ fosforylering til et skift i substratpræference, idet hexokinase blev afhængig af et intramitokondrielt kompartment af ATP, som blev bestemt af hastigheden af oxidativ fosforylering og var uafhængig af det ekstramitokondrielle.
Glukose (Glc)-fosforylering ved mitokondrielt bundet hexokinase med ATP, der dannes ved oxidativ fosforylering i nærværelse af stigende koncentrationer af eksogen ATP. ATP-produktion ved oxidativ fosforylering blev igangsat ved tilsætning af ADP på det angivne tidspunkt. Glc-fosforylering blev koblet til NADPH-produktion, der blev overvåget ved absorbans ved 340 nm (A), i tilstedeværelse af overskydende glucose-6-fosfat (Glc-6-P)-dehydrogenase. Koncentrationerne af eksogen ATP, der var til stede på tidspunktet for ADP-tilsætningen, var henholdsvis 1,1, 0,66, 0,22 og 0 mmol l-1 for kurverne A-D. Bemærk, at den opnåede steady state var uafhængig af den oprindeligextramitokondrielle . Genudtrykt med tilladelse fra BeltrandelRio ogWilson (1992b).
Men selv om ATP-produktionen begyndte næsten straks efter initiering af oxidativ fosforylering ved tilsætning af ADP, var der en markant forsinkelse i initiering af Glc-fosforylering af den mitokondriebundne hexokinase (Fig. 3D), før der blev opnået en steady state-hastighed, der varede i en længere periode. Denne indledende forsinkelsesperiode blev fortolket som den tid, der var nødvendig for at fylde et intramitokondrielt rum med ATP, der var genereret ved oxidativ fosforylering, og hvorfra den mitokondrielt bundne hexokinase hentede sit substrat ATP. Hæmning af elektrontransporten ved tilsætning af KCN resulterede i en tilsyneladende frigivelse af ATP, formentlig fra det intramitokondrielle rum, og egenskaberne af dette “rum” (fyldningskinetik, forbindelse til intramitokondriel ATP-produktion osv.) var i tilfredsstillende overensstemmelse med forventningerne baseret på denne fortolkning (BeltrandelRio og Wilson,1991,1992a,b).Desværre er overensstemmelse med forventningerne ikke en ufejlbarlig vejviser for sandheden, og den “tilsyneladende frigivelse af ATP” viste sig efterfølgende at være et artefakt (Laterveer et al.,1993).), hvis kilde stadig ikke er forstået, og som ikke kunne reproduceres i senere arbejde (deCerqueira Cesar og Wilson, 1998). På trods af dette nedslående og pinlige tilbageslag blev det grundlæggende koncept om kobling af mitokondriebundet hexokinase til et intramitokondriekompartment af ATP støttet af andre beviser og har modstået efterfølgende eksperimentelle afprøvninger.
En metode til dobbelt isotopmærkning blev udviklet som et alternativ til de spektrofotometriske procedurer (deCerqueira Cesar og Wilson, 1995). 14C-mærket Glc blev anvendt som substrat til hexokinase, og 32Pi leverede et substrat til ATP-syntese ved oxidativ fosforylering. Forholdet32P/14C i Glc-6-P gav således et mål for den specifikke aktivitet af substrat ATP, der anvendes af hexokinase. Forholdet32P/14C i Glc-6-P produceret af mitokondriebundet hexokinase blev sammenlignet med det, der blev produceret af gærhexokinase, som ikke binder sig til mitokondrier og derfor nødvendigvis anvender extramitokondrie-ATP som substrat. Kinetikken for mærkning af de ATP-puljer, der anvendes som substrat af mitokondriebundet hexokinase og gærhexokinase, var påfaldende forskellig,hvilket igen er i overensstemmelse med det synspunkt, at mitokondriebundet hexokinase ikke anvender extramitokondrie-ATP som substrat, men snarere trækker på et intramitokondrieelt kompartment af ATP, der tilvejebringes ved oxidativ fosforylering.For eksempel (fig. 4) resulterede tilsætning af overskydende 31Pi, hvorved den specifikke aktivitet af den 32P-ATP, der er syntetiseret ved oxidativ fosforylering, blev markant nedsat, i et hurtigt fald i 32P/14C-forholdet af Glc-6-P produceret af gærhexokinase ved hjælp af extramitokondriel ATP (fig. 4). Derimod var der en forsinkelse og efterfølgende et noget langsommere fald i 32P/14C-forholdet af Glc-6-P produceret af mitokondrielt bundet hexokinase. Sidstnævnte observationer var igen i overensstemmelse med det synspunkt, at den mitokondrielle hexokinase udnyttede et intramitokondrielt ATP-kompartment, der ikke var frit i ligevægt med extramitokondrielt ATP.
Effekt af tilsætning af overskydende umarkeret Pi på32P/14C-forholdet af glukose-6-fosfat (Glc-6-P) dannet afmitochondrielt bundet hexokinase eller ikke-mitochondrielt bundet gærhexokinase.Oxidativ fosforylering blev indledt med32Pipræsenteret som substrat for oxidativ fosforylering og Glc assubstrate for hexokinase. Efter 3 minutter blev der tilsat overskydende 31Pi, hvilket reducerede den specifikke aktivitet af ATP, der efterfølgende blev produceret ved oxidativ fosforylering. Dette resulterede i et hastigt fald i32P/14C-forholdet af Glc-6-P dannet af gærhexokinase (firkanter) ved hjælp af extramitokondriel ATP som substrat, men et meget langsommere fald i 32P/14C-forholdet af Glc-6-P dannet afmitokondrielt bundet hexokinase (åbne cirkler). Udfyldte cirkler, samlet Glc-6-P produceret af mitokondrielt bundet hexokinase. Genoptrykt med tilladelse fra de Cerqueira Cesar og Wilson (1995).
En anden eksperimentel fremgangsmåde var baseret på en sammenligning af demitokondrielt bundet hexokinase og det ikke-bundne gærenzym (de Cerqueira Cesar og Wilson, 1998,2002). Den underliggende logik er illustreret i fig. 5. En fast mængde hjernemitokondrier med bundet hexokinase blandes med stigende mængder mitokondrier fra rottelever, som ikke indeholder bundet hexokinase. Både hjerne- og levermitokondrier er aktivt fosforylerende, og der er således en stigende ATP-produktion i systemet, efterhånden som mængden af levermitokondrier øges. Koncentrationen af extramitokondrielt ATP holdes undermættet, dvs. ÅKm hexokinas med extramitokondrielt ATP som substrat (i fravær af oxidativ fosforylering). Hvis den mitokondriebundne hexokinase anvender ekstramitokondrielt ATP som substrat, forventes en progressiv stigning i Glc-fosforyleringshastigheden, efterhånden som ATP-produktionshastigheden øges ved tilsætning af stigende mængder levermitokondrier. Faktisk er det ikke det, der er observeret; snarere er hastigheden af Glc-fosforylering af demitokondrielt bundet hexokinase ikke signifikant påvirket af stigningen i ATP-produktionshastigheden (fig. 6). Derimod ses den forventede stigning i Glc-fosforyleringshastigheden, hvis den mitokondrielle hexokinase erstattes af en ækvivalent mængde gærhexokinase. Disse resultater er således igen i overensstemmelse med den opfattelse, at mitokondrielt bundet hexokinase anvender intramitokondrielt ATP, der er intrinsisk for de mitokondrier, som hexokinasen er associeret med, men uafhængigt af eventuelle stigninger i intramitokondrielt ATP, der stammer fra de hexokinasefri levermitokondrier.
Skematisk fremstilling af den eksperimentelle strategi til sammenligning af udnyttelsen af ekstramitokondriel ATP af mitokondriebundet hexokinase eller ikke-bundet gærhexokinase. (A) Mitokondrielt bundet hexokinase (HK) er repræsenteret i midten af panelet, med yderligere mitokondrier, der indeholder lidt eller ingen bundet hexokinase, vist i mere perifere regioner.Til sidstnævnte blev der i tidligere forsøg anvendt mitokondrier fra rottehjerne, der var blevet udtømt for hexokinase ved behandling med glukose-6-fosfat, som forårsager frigivelse af demitokondrielt bundet hexokinase. I de senere eksperimenter blev der imidlertid anvendt mitokondrier fra rottelever, der som isoleret ikke indeholder bundet hexokinase. Ekstramitokondrielt ATP er fordelt i hele det ekstramitokondrielle rum. (B) Analog situation, men med en tilsvarende mængde ikkemitokondrielt bundet gærhexokinase (YHK) i stedet for demitokondrielt bundet hexokinase. Den grundlæggende strategi er at bestemme hastigheden af glukosephosphorylering ved en fast mængde bundet eller ikke-bundet hexokinase, idet hastigheden af den extramitokondrielle ATP-produktion øges ved tilsætning af et stigende antal mitokondrier uden bundet hexokinase. Genudtrykt med tilladelse fra de Cerqueira Cesar og Wilson (2002).
Glucose (Glc)-fosforyleringshastighed ved mitokondrielt bundet og ikke-bundet hexokinase med stigende ATP-produktionshastighed fra oxidativ fosforylering. Hastigheden af Glc-fosforylering (v̇) er udtrykt i forhold til den maksimale fosforyleringshastighed (V̇), sidstnævnte bestemt med mættende niveauer af eksogent ATP i fravær af oxidativ fosforylering. Glc-6-P-produktionshastigheden med ikke-mitochondrielt bundet gærhexokinase (cirkler) er tæt korreleret med ATP-produktionshastigheden. I modsætning hertil er hastigheden af Glc-fosforylering med mitokondrielt bundet hexokinase (firkanter) ufølsom over for stigende niveauer af extramitokondrielt ATP produceret af mitokondrier uden hexokinase, hvilket er i overensstemmelse med det synspunkt, at det mitokondrielt bundne enzym er begrænset til intramitokondrielt ATP, der produceres af de mitokondrier, som enzymet er bundet til, som substrat. Genoptrykt med tilladelse fra de Cerqueira Cesar og Wilson (1998).
Endeligt er der yderligere beviser for den opfattelse, at mitokondriebundet hexokinase kan skelne mellem intra- og extramitokondriel ATP, ved at undersøge inhibering med Glc-6-P-analogen, 1,5-anhydroglucitol-6-P(1,5-AnG6P). I fravær af oxidativ fosforylering og med ekstramitokondrielt ATP som substrat er 1,5-AnG6P en ret potent hæmmer, der er konkurrencedygtig i forhold til ATP (Fig.7) (Hashimoto og Wilson,2000) (Hashimoto og Wilson,2000). I modsætning hertil er 1,5-AnG6P med ATP tilført ved oxidativ fosforylering meget mindre effektiv som inhibitor. Det er klart, at ATP fra oxidativ fosforylering ikke er ækvivalent med ekstramitokondriel ATP. Lignende resultater er for nylig blevet rapporteret ved brug af demitokondriel hexokinase fra bovin hjerne (de Cerqueira og Wilson, 2002).
Hæmning af mitokondrielt bundet hexokinase med glukose-6-fosfatanalogen, 1,5-anhydroglucitol-6-P (1,5-AnG6P), med intramitokondrielt dannet (åbne cirkler) eller extramitokondrielt (fyldte cirkler) ATP-substrat. Genudtrykt med tilladelse fra Hashimoto og Wilson (2000).
Kort sagt er det nuværende synspunkt, at mitokondriel hexokinase i fravær af oxidativ fosforylering let kan anvende extramitokondriel ATP efter klassisk Michaelis-Menten-kinetik. Under aktiv oxidativ fosforylering er det mitokondrielt bundne enzym imidlertid koblet til en intramitokondriel ATP-pulje, idet Glc-fosforyleringshastigheden er tæt korreleret med oxidativ fosforylering.Det forekommer vanskeligt at tro, at mitokondrier i normalt væv nogensinde er i en fuldstændig ikke-fosforylerende tilstand. Ændringer i hastigheden? Ja, selvfølgelig, afhængigt af udsving i energibehovet. Men virkelig ikke-fosforylerende? Sandsynligvis kun under de mest alvorlige – og i sidste ende dødelige – omstændigheder. Det følger heraf, at Glc-fosforyleringshastigheden under normale forhold er tæt koordineret med de terminale oxidative faser af Glcmetabolismen, der finder sted i mitokondrierne med tilhørende produktion af ATP ved oxidativ fosforylering. Som tidligere bemærket (BeltrandelRio og Wilson, 1992a) kan en sådan koordinering sikre, at Glc indføres i det glycolytiske stofskifte med en hastighed, der svarer til de terminale oxidative stadier, og at produktion af neurotoksisk laktat undgås (Marie og Bralet, 1991), samtidig med at nettoflow gennem den cytoplasmatiske og mitokondrielle del af vejen sikres med en hastighed, der er tilstrækkelig til at opfylde energibehovet (fig. 8).
Koordinering af de glycolytiske og oxidative faser i glukose(Glc)metabolismen. Hastigheden af Glc-fosforylering af mitokondriebundet hexokinase, der anvender intramitokondriegenereret ATP som substrat, er korreleret med hastigheden af oxidativ fosforylering. Denne mekanisme foreslås at sikre koordinering af Glc-fosforylering, det indledende trin i det glykolytiske stofskifte, med de terminale oxidative stadier (tricarboxylsyrecyklus med tilhørende elektrontransport og oxidativ fosforylering; fede buede pile), der finder sted i mitokondrierne, hvorved man undgår ophobning af potentielt giftigt laktat.
Det vides ikke, hvordan denne bemærkelsesværdige ændring i substratspecificitet (intramitokondrielt versus extramitokondrielt ATP) induceres af oxidativ fosforylering, men det er klart, at konformationen af det mitokondrielt bundne enzym påvirkes af mitokondrielt membranpotentiale samt andre faktorer relateret til mitokondriefunktion, hvilket tyder på et intimt samspil mellem den indre (hvor membranpotentialet findes) og den ydre (hvortil hexokinase er bundet) membran i denne organel (Hashimoto og Wilson, 2000).Konformationsændringer, der påvirker de områder af molekylet, der er involveret i bindingen af substrat ATP, er tidligere blevet postuleret (de Cerquiera og Wilson, 1998) som værende ansvarlige for ændringer i substratspecificitet.