“En molekylær genetisk teknik, der anvendes til direkte manipulation, ændring eller modifikation af gener eller genomet i organismer med henblik på at manipulere fænotyperne, kaldes genteknologi.”

Og med andre ord kan vi sige:

“Genteknologi er en teknik, ved hjælp af hvilken den genetiske sammensætning af en organisme kan ændres.”

Teknikken er ofte kendt som genetisk manipulation, genetisk modifikation eller genetiske ændringer, bredt set kategoriseres den som genteknologi.

I denne teknik konstrueres et rekombinant DNA, som indsættes i værtsgenomet ved hjælp af en vektor. Eller vi kan slette nogle mutante sekvenser fra et genom. Det første rekombinante DNA blev konstrueret af Paul Berg i 1972.

Med den genteknologiske teknik kan man konstruere genetisk modificerede organismer, som er økonomisk meget vigtige for os.

Det anvendes til produktion af forbedrede plantearter, terapeutiske lægemidler eller proteiner, forebyggelse af arvelige genetiske lidelser og konstruktion af en genetisk modificeret organisme.

I denne artikel vil vi vores hovedopgave være genteknologi og dens anvendelser. Indholdet af artiklen er,

• Hvad er genteknologi
  • Definition
  • Historie
  • Typer
  • Typer
  • Proces
• Anvendelse af genteknologi
• Begrænsninger ved genteknologi
• Konklusion

Mennesker har længe manipuleret med det genetiske materiale i mange organismer. Ved hjælp af selektiv avl og krydsningshybridisering har vi skabt økonomisk vigtige plantearter.

Sigtet med at udvikle genteknologien eller den genetiske manipuleringsteknik er at frembringe organismer eller fænotyper, som er nyttige for os. Gensplejsningsteknikker anvendes til,

• Bygning af genetisk modificerede plantearter.
• Abiotiske og biotiske stressresistente plantearter.
• Økonomisk vigtige plantearter
• Kommercielt værdifulde organismer
• Til fremstilling af terapeutiske lægemidler
• Forebyggelse af genetiske abnormiteter.

“Ved genteknologi kombineres to forskellige cellers DNA og indsættes i værtsgenomet via en vektor.” Her forklares vigtige komponenter i eksperimenterne med genmanipulation.

Gen af interesse: En DNA-sekvens, som vi ønsker at indsætte i vores målceller.

Vektor: Ved hjælp af plasmid-DNA-lignende vektorer indsættes genet af interesse i værtsgenomet. Vektorer er en slags køretøjer, der overfører det genetiske materiale.

Målceller: Målceller er den population af celler, hvis genom vi ønsker at manipulere eller ændre.

Definitioner:

“En teknik, der anvendes til at indsætte eller slette et mutant gen eller til at manipulere en organismes genom, kaldes genteknologi.”

Gensplejsningens historie:

Udtrykket genteknologi blev først brugt af en science fiction-forfatter og ikke af nogen videnskabsmand. I 1951 brugte Jack Williamson udtrykket “genteknologi” for første gang i sin roman “Dragon’s island”.

Snart derefter blev DNA’s molekylære struktur opdaget af Watson og Crick, selv om genetiske eksperimenter var populære siden Mendels tid.

Det første rekombinante DNA blev konstrueret af Paul Berg i 1972. Samme år udførte Herbert Boyer og Stanley Cohen eksperimenter med genoverførsel. I 1974 havde Rudolf Jaenisch skabt genetisk modificerede mus, hvilket var første gang i genetikkens historie.

Efter Rudolfs succes blev den genetisk modificerede eller genetisk manipulerede tobaksplantearten udviklet i 1976.

I denne periode (mellem 1960 og 1990) blev der opdaget restriktionsfordøjelses-, ligations- og PCR-lignende teknikker, som gav vinger til den gensplejsende teknologi.

Relateret artikel:

Type af genteknologiske teknikker: Hvad er et genom?

Rekombinant DNA- En rekombinant DNA-teknologi er en type genteknisk teknologi, hvor et kunstigt DNA-molekyle konstrueres ved at ligere to forskellige DNA’er ved hjælp af fysiske metoder. Hertil indsættes det pågældende gen i plasmidvektoren og anvendes til genoverførselsforsøg.

Genoverførsel – Genoverførselsteknik anvendes til at indsætte et gen af interesse i værtsgenomet.

Elektroforering, opfordring og viral vektor-medieret genoverførsel, liposom-medieret genoverførsel, transposon-medieret genoverførsel er nogle af de metoder, der anvendes til dette.

Genredigering- En genredigeringsteknik anvendes til at redigere genomet, hvor en uønsket DNA-sekvens fjernes, eller et nyt gen kan indsættes i værtsgenomet. CRISPR-CAS9, TALEN og ZFN er nogle kendte genredigeringsværktøjer, der anvendes i genterapi-forsøg.

Læs mere: Hvad er genredigering og CRISPR-CAS9?

Proces for genteknologi:

Genmanipulationsteknikken anvendes til mange forskellige formål, og derfor skal vi først beslutte, hvad formålet med forsøget er. Hele genteknologiprocessen kan inddeles i 5 mere overordnede trin:

• Udvælgelse og isolering af kandidatgenet
• Udvælgelse og konstruktion af plasmid
• Gentransformation
• Insættelse af DNA i værtsgenomet
• Bekræftelse af indsættelse

Udvælgelse og isolering af kandidatgenet:

Genet skal indeholde en DNA-sekvens, som vi ønsker at undersøge, og til det formål har et gen nogle særlige egenskaber. Et kandidatgen skal have et højt GC-indhold og en lavere repetitiv DNA-sekvens.

Dertil kommer, at det interessante gen ikke må være for langt – kun nogle få kb gener kan indsættes med succes. Længere gen er større chance for fiasko. Kandidatgenet skal have et start- og stopkodon i det. Relateret artikel: Hvad er den genetiske kode?

Nu kan det interessante gen isoleres fra resten af DNA’et ved hjælp af enten restriktionsfordøjelse eller polymerasekædereaktion.

Restriktionsendonukleaserne er det bakterielle enzym, der har evnen til at fordøje DNA-sekvensen på et bestemt sted. Ved hjælp af en specifik type restriktionsendonuklease kan vi skære og isolere vores gen af interesse.

Restriktionsfordøjelsesmetoden er forklaret i vores tidligere artikel: Hvad er restriktionsfordøjelse?

I polymerasekædereaktionen forstærkes det interessante gen eller kandidatgenet i termocykleren ved hjælp af oplysningerne om gensekvensen.

Maskinen laver ved hjælp af polymerasekædereaktionen millioner af kopier af et gen af vores interesse. Ved hjælp af agarosegelelektroforese isoleres det forstærkede gen.

Hvis genet af interesse tidligere er godt undersøgt, er genets oplysninger tilgængelige i det genetiske bibliotek, og vi kan bruge dem til kunstig syntese af et gen af vores interesse. (ved hjælp af oplysningerne fra det genetiske bibliotek kan genet også syntetiseres kunstigt)

I næste trin udføres der om nødvendigt en DNA-rensning. Nu er vores DNA klar til at blive indsat i et plasmid.

Udvælgelse og konstruktion af plasmidet:

Vælgelse af plasmidet til det genteknologiske forsøg er et af de afgørende trin i hele forsøget. Før man vælger plasmidet, skal man forstå, hvorfor plasmidet bruges i genoverførselsforsøgene.

Plasmid-DNA’et er et cirkulært, dobbeltstrenget cytoplasma-DNA fra bakterierne, der replikerer uafhængigt af hinanden.

Videnskabsfolk bruger det som et middel til at overføre det pågældende gen til målstedet i genomet. Det kan effektivt overføre genet på målstedet. Plasmidets struktur er forklaret i nedenstående figur,

Relateret artikel:

: Hvad er et plasmid?

Fremstilling af plasmid:

Vælg det plasmid, der passer til dit forsøg.

Plasmidet skal have replikationsoprindelse, promotorregion, antibiotikaresistensgen og andre vigtige sekvenser. Ved hjælp af restriktionsfordøjelsesmetoden indføres der et indsættelsessted i plasmidet, hvor vores gen af interesse ligeres.

Gennem anvendelse af T4-dna-ligase som power sealer indsættes og ligeres DNA’et af vores interesse i plasmidet. Sammen med plasmidet indføres der også en selekterbar markør i plasmid-DNA’et for at identificere det rekombinante DNA.

Dertil kommer, at en promotorregion og terminatorsekvenser også er inkluderet i plasmidet for at sikre effektiv ekspression af et gen af vores interesse. Et plasmid med vores gen af interesse og nogle andre vigtige sekvenser betegnes nu som et rekombinant DNA-molekyle.

Nu er vores rekombinante DNA klar til ekspression.

Hvis vi udfører genkloning, indsættes plasmidet i den bakterielle vært, hvortil man almindeligvis anvender E.Coli. Når bakterien begynder at dele sig, replikeres vores rekombinante plasmid-DNA også sammen med den.

Nu har vi flere kopier af vores plasmid-DNA, som ekstraheres ved hjælp af plasmid-DNA-ekstraktionssættet og anvendes til transformationsforsøgene.

Transformation i værtsgenomet:

Transport af det rekombinante DNA ind i modtagercellen eller værtsgenomet er endnu en kedelig og vanskelig opgave. Der anvendes forskellige metoder til indsættelse af rekombinant DNA til forskellige celletyper, fordi en enkelt metode ikke kan anvendes til alle celletyper.

Forskellige metoder til transformation:

Anvendelse af stress – bakterier optager let plasmid-DNA’et ved hjælp af nogle stressfaktorer som f.eks. varme eller elektrisk strømforsyning.

Mikroinjektion- en skarp nål bruges til at indsætte DNA direkte i cellens kerne, men metoden er mindre effektiv og kræver et højere niveau af ekspertise til det.

Elektroporation- en af de bedste metoder, der har en stor succesrate, er elektroforeringsmetoden, hvor det rekombinante DNA indsættes i værtsgenomet ved at permeabilisere cellen med elektrisk strøm.

Vi har dækket en hel artikel om det. Læs den her: Elektroporation – en moderne genoverførselsteknik.

Sonikation- sonikation er endnu en god metode, der nogle gange anvendes i genoverførselsforsøget, hvor det rekombinante DNA indsættes i målcellen ved hjælp af ultralydsbølger. Ultralydsbølgerne øger også cellernes permeabilitet.

Liposomformet genoverførsel- Ved hjælp af en kunstig celle-lignende ydre kappe, kendt som et liposom- kan rekombinant DNA indsættes i værtsgenomet.

Genoverførsel ved hjælp af bakterieinfektion- Denne metode er en af de populære metoder og anvendes rutinemæssigt i plantegenetiske eksperimenter. Her inficeres plantearten med de transformerede bakterier med henblik på at indsætte et gen af interesse.

Agrobacterium tumifecian anvendes til at indsætte rekombinant DNA i plantecellen. Et gen af interesse indsættes i Ti-plasmidet i Agrobacterium. Plantecellerne inficeres af denne bakteriecellekultur, og de transformerede celler regenereres ved hjælp af plantevævskulturmetoder.

Kemisk i genoverførsel- Nogle metalioner, kemikalier og opløsninger af forskellige kemikalier anvendes også i genoverførselsforsøgene, men succesraten er for lav sammenlignet med de andre metoder.

Bekræftelse af indsættelse:

Vores arbejde er stadig ikke afsluttet.

Nu skal vi konforme, om det rekombinante DNA er indsat i vores målcelle eller ej. Der anvendes forskellige molekylærgenetiske teknologier til det. I den traditionelle dyrkningsmetode anvendes tilstedeværelsen eller fraværet af en selekterbar markør til at skelne transformerede celler fra de utransformerede celler.

Det er dog ikke nødvendigt for den PCR-baserede detektionsmetode. Den polymerasekædereaktionsbaserede detektionsmetode er bredt accepteret og mere pålidelig end andre metoder.

DNA ekstraheres fra den transformerede celle og amplificeres ved hjælp af primere, der er komplementære til vores gen af interesse eller vores rekombinante DNA.

Hvis det rekombinante DNA er til stede, amplificeres det helt sikkert, ellers opnås ingen amplifikation. For tofaktorskonformationen anvendes et primersæt, der er komplementært til det rekombinante DNA-specifikke, og et primersæt, der er komplementært til den selekterbare markørsekvens, og der udføres multiplex-PCR.

For at validere resultaterne skal der opnås amplifikation i begge reaktioner.

Men vent et øjeblik!

Hvad sker der, hvis der under forsøget sker en mutation i vores gen af interesse? Fordi PCR’en kun kan forstærke DNA’et. Vi skal bruge sekvensoplysninger for at kunne påvise mutationen.

Dertil bruges DNA-sekventeringsmetoden.

DNA ekstraheres fra de transformerede celler, og genet af interesse forstærkes ved hjælp af PCR. Nu bruges PCR-amplikonerne til DNA-sekventering, hvor sekvensen af vores gen af interesse ved hjælp af fluorescerende kemi bestemmes på ordentlig vis.

Når alle parametre til bestemmelse af det pågældende gen er opfyldt, er vores celler nu klar til at blive injiceret i værtsorganismen eller til vævskulturforsøg.

Anvendelse af genteknologi:

Nu kommer vi til det vigtige punkt i dette emne: “Hvad bruges genteknologi til?”

Genteknologi har stor industriel og landbrugsmæssig værdi. Den anvendes inden for medicin, genetisk forskning, landbrug, forbedring af afgrøder og til fremstilling af terapeutiske lægemidler.

Det anvendes også til udvikling af genetisk modificerede organismer. Her diskuterer vi nogle af de vigtige anvendelser af genteknologi.

Den rekombinante DNA-teknologi anvendes til forbedring af afgrøder og udvikling af nye økonomisk vigtige egenskaber. Nogle af dem er:

• Herbicidresistens
• Virusresistens
• Forskudt modning af frugter
• Forandret olieindhold
• Pollenkontrol
• Udvikling af kulde- og tørketolerante plantearter.

Et klassisk eksempel er BT-bomuld – en af typerne af genetisk modificerede arter giver planten resistens mod Bacillus thuringiensis.

Processen for udvikling af genetisk modificerede plantearter:

Et gen af interesse isoleres fra organismen ved hjælp af restriktionsfordøjelse eller forstærkes ved hjælp af polymerasekædereaktion. Rekombinant DNA konstrueres ved at indsætte et gen af interesse i plasmidet, her anvendes T-plasmidet.

I det næste trin indsættes T-plasmidet i agrobacterium. I det sidste trin inficeres plantearten med de transformerede bakterieceller og dyrkes. Hele processen er vist i figuren nedenfor,

GMF- genetisk modificerede fødevarer er en anden bedste anvendelse af genteknologi, hvor økonomisk vigtige fødevarer konstrueres ved hjælp af rekombinant DNA-teknologi.

Det klassiske eksempel herpå er Flavr Savr-tomaten, en genetisk modificeret tomatart, der består af antisense RNA-teknologi. Den har store økonomiske værdier, da GM-tomaten let kan transporteres fra et sted til et andet sted.

En anden vigtig anvendelse af genteknologi er genetisk modificerede eller genetisk manipulerede fødevarer.

Kvaliteten af nogle af fødevareprodukterne som f.eks. bomuld, majs og sojabønner forbedres ved hjælp af den nuværende rekombinante DNA-teknologi. Formålet med at udvikle genetisk modificerede afgrøder eller plantearter er at gøre dem økonomisk vigtige, næringsrige, proteinrige, sygdoms- og stressresistente.

Selv ved hjælp af genteknologi og vævskulturteknikker udvikles insekticidresistente plantearter i tobak, kartofler, majs og bomuld.

Dertil kommer, at der også kan skabes nogle modificerede planter, der er i stand til at generere deres egne gødningsstoffer, ved hjælp af den nuværende genmodifikationsteknik.

Transgene modelorganismer udvikles til at teste forskellige parametre – funktionen af visse gener kan bestemmes ved at designe de transgene mikroorganismer og dyremodeller.

Skadelige patogener og insekticider kan destrueres ved hjælp af genetisk modificerede mikroorganismer, som er i stand til at nedbryde giftige stoffer.

Medicinske anvendelser:

Lavprismedicin, hormoner, enzymer og vacciner fremstilles ved hjælp af genteknologiske værktøjer.

Blodpropper er det bedste eksempel herpå, hvor det plasminogenaktiverende enzym, som er i stand til at opløse blodproppen, konstrueres kunstigt og anvendes til patienter med koronararteriesygdom eller hjerteanfald.

Andre eksempler er to andre terapeutiske proteiner somatostatin og lymfokiner, som virker mod flere sygdomstilstande og kan syntetiseres kunstigt. Insulin er endnu et klassisk eksempel på et terapeutisk protein, der er udviklet ved hjælp af genteknisk teknologi.

Et gen for insulin isoleres ved restriktionsfordøjelse eller ved PCR og indsættes i plasmidet. Det rekombinante plasmid-DNA indsættes straks i den bakterie- eller gærcelle, hvori plasmidet formerer sig. Når mikroorganismen begynder at dele sig, begynder den at producere kunstigt insulin.

En stor mængde insulin fremstilles ved hjælp af den samme teknik i industriel skala. Den detaljerede skitse af insulinproduktionen er vist i nedenstående figur,

Den kommercielle produktion af insulin startede efter FDA’s godkendelse i 1982.

Rekombinante vacciner:

Vacciner mod kopper, herpes simplex-virus og hepatitis fremstilles ved hjælp af genteknisk teknik. Vaccinerne er de inaktiverede viruspartikler, der bruges til at fremkalde et immunrespons mod det pågældende patogen, men risikoen for kontaminering er dog stor i det.

Ved hjælp af den rekombinante DNA-teknologi har forskere skabt en unik type vacciner, der kun indeholder DNA’et til det virale kappeprotein, så patogenet aldrig kan aktiveres igen. Den største fordel ved den er, at den er mere sikker, forureningsfri og mere reaktiv.

Geneteknologi i genterapi:

Med hjælp af genterapi eller genoverførselsteknik kan arvelige genetiske sygdomme helbredes. Cystisk fibrose, Duchenne muskeldystrofi og seglcelleanæmi lignende genterapier er nu i den afsluttende kliniske forsøgsfase og klar til at blive anvendt på patienter.

I genterapien erstattes et defekt, ikke-fungerende eller muteret gen med et vildtype-gen ved hjælp af den samme teknik som forklaret ovenfor.

Vi har dækket fantastiske artikler om genterapi, læs det her:

1. Genterapi: Typer, vektorer , proces, anvendelser og begrænsninger.
2. Hvad er genterapi? og hvordan virker det?
3. Naked DNA-medieret genterapi
4. Sleeping Beauty Transposon System: Fremtiden for genterapi

Ud over dette anvendes genteknologien ligeledes til produktion af biobrændstof, sygdom, bioalkohol og andre vigtige produkter.

Begrænsninger ved genteknologi:

Der er etiske spørgsmål forbundet med brugen af genterapi og genmanipulerede produkter.

Og for at give fødevareproduktet eller ethvert genetisk modificeret produkt en økonomisk værdi går man også på kompromis med de ernæringsmæssige værdier.

På grund af den negative virkning heraf udvikles der hurtigere nye resistente patogene stammer.

Dertil kommer, at bivirkningerne ved genterapi og brugen af virus i den er skadelige for målorganismen.

Teknologien er dyrere, da genterapi koster op til 50.000 USD.

Konklusion:

Det er imod naturloven at lege med embryonet eller fosteret, men folk tror stærkt på det, og derfor bliver genetisk modificerede fødevarer og planteprodukter altid et omdrejningspunkt for kontroverser.

Men ved hjælp af genteknologiske værktøjer som f.eks. genterapi og genoverførselsteknik kan arvelige lidelser og kræftlignende dødelige sygdomme forhindres. Positiv anvendelse af genteknikker kan ændre menneskehedens skæbne.

Kilder:

1. National Research Council (USA) Committee on Identifying and Assessing Unintended Effects of Genetically Engineered Foods on Human Health (Udvalget om identifikation og vurdering af utilsigtede virkninger af genetisk modificerede fødevarer på menneskers sundhed). Sikkerhed af genetisk modificerede fødevarer: Approaches to Assessing Unintended Health Effects. Washington (DC): National Academies Press (US); 2004. 2, Methods and Mechanisms for Genetic Manipulation of Plants, Animals, and Microorganisms.
2. Wallace RB. Principper for genmanipulation. En introduktion til genteknologi. Studier i mikrobiologi. Am J Hum Genet. 1981;33(4):652-653.