Gene targeting i embryonale stamceller

Gennem processen med gene targeting i ES-celler kan potentielt enhver genetisk ønsket genetisk manipulation indføres i musenes kimlinje. Specifikke gensekvenser kan slettes enten konstitutivt eller betinget (Knock-out), specifikke mutationer eller baseparændringer kan foretages præcist inden for et gen af interesse, og reportergener eller andre ekspressionskassetter kan indføres på definerede steder i genomet (Knock-in). Murinsekvenser kan udskiftes med menneskelige sekvenser ved hjælp af denne teknologi for at generere humaniserede musemodeller.

Denne teknik kan tage op til et års udviklingstid, så det er vigtigt at investere meget tid i begyndelsen af projektet for at sikre, at der vælges den mest hensigtsmæssige teknologi og genetiske strategi til den ønskede model. Den transgene kerne kan yde rådgivning i forbindelse med denne type beslutninger, og det er vigtigt, at alle målretningsprojekter drøftes indgående med kernen, inden arbejdet påbegyndes i laboratoriet.

Når der er truffet beslutning om en strategi, konstrueres en målretningsvektor, og der udarbejdes og afprøves en robust screeningsstrategi for at sikre, at den krævede genomiske manipulation kan påvises på genomisk niveau. Targeting-vektoren transficeres derefter i ES-celler, og rekombinante kloner screenes for den ønskede homologe rekombinationsbegivenhed. Disse celler injiceres derefter i præimplantationsembryoner, og de resulterende kimære mus anvendes til avl af den genetisk modificerede muselinje.

Service

Der tilbydes en fleksibel service, som kan opdeles i de specifikke faser af modeludviklingen, afhængigt af de tilgængelige ressourcer.

Projektstart – gratis

• Konsulentbistand til gruppen med henblik på at finde frem til en passende teknologi for at opnå en sikker, anvendelig model
• Screening af genfælde-databaser for allerede eksisterende ES-cellekloner
• Screening af Knock-out-konsortiets ressourcer for allerede eksisterende målretningsvektorer, ES-cellekloner og modeller

Konsulentbistand til konstruktion af målrettet vektor – gratis

• Genomisk sekvensanalyse for at identificere regioner, der har en høj sandsynlighed for at være anvendelige homologiregioner til genmålretning
• Konsulentbistand med gruppen for at finde frem til den genetiske strategi, der er nødvendig for at opnå en sikker, brugbar model
• Konstruktion af målretningsvektoren leveres ikke af kernen, men kernen kan bistå med tilvejebringelse af kassetter og rådgivning om metodologi
• Etablering af screeningsstrategi leveres ikke af kernen, men kernen kan bistå med tilvejebringelse af kassetter og metodologi rådgivning

Gen Targeting i embryonale stamceller

• Transfektion af den færdige targetingvektor i embryonale stamceller
• Isolering og opbevaring af mindst 192 uafhængige rekombinante cellekloner
• DNA-præparering og levering af 96 brøndplader til screening
• Tøning, Ekspansion af formodede positive kloner
• Troduktion af yderligere DNA-præparat fra formodede positive kloner til bekræftelsesscreening
• Karyotypeanalyse af målklonerne

Blastocystinjektion af ES-cellekloner

• Injektion af ES-celler i præimplantationsembryoner
• Generering og opstaldning af kimærer i op til 3 uger.
• Anbefalinger til avlsstrategi