Forbedring af sædkvaliteten i hyperviskøs sæd efter DNase I-behandling
Abstract
Hyperviskositet i sæd forringer sædmotiliteten og kan føre til mandlig infertilitet. Denne prospektive undersøgelse havde til formål at vurdere eksogen DNases evne til at forbedre sædkvaliteten under hensyntagen til, at DNase er fundet i sædplasmaet hos flere arter, og at neutrofile frigiver kromatin for at fange bakterier. I alt syvoghalvfjerdsindstyve sædprøver med høj seminal viskositet (HSV) som undersøgelsesgruppe og toogtres sædprøver med normal seminal viskositet (NSV) som kontrolgruppe blev sammenlignet i denne analyse. Disse sædprøver blev inddelt i tre grupper, der blev behandlet a) med DNase I ved 37 °C i 15 minutter, b) ved tæthedsgradientcentrifugering og c) med en kombination af de to ovennævnte metoder. Efter 15 minutters behandling af hyperviskøs sæd steg motiliteten af spermatozoer i 83 % af sædprøverne i statistisk signifikant grad. DNase-behandling af sæd med normal viskositet havde derimod ingen sådanne virkninger. Ovennævnte behandling var også ledsaget af en betydelig stigning i procentdelen af normale spermatozoer, hvilket resulterede i et stort fald i teratozoospermia-indekset. En sammenligning mellem sædprøver, der blev centrifugeret med tæthedsgradient efter DNase I-behandling, og sædprøver, der blev opsamlet efter tæthedsgradientbehandling alene, viste, at resultaterne i det første tilfælde var mere spektakulære. Evalueringen af hvert præparat med hensyn til udbytte (% af det samlede antal progressivt motile sædceller efter behandlingen i forhold til det oprindelige samlede antal sædceller) viste, at den kombinerede fremgangsmåde resulterede i 29,8 % vs. 18,5 % med tæthedsgradientbehandling alene (p=0,0121). DNase I-behandling resulterer i en forbedring af sædmotilitet og morfologi og kunne være til gavn for mænd med hyperviskøs sæd i protokoller for assisteret reproduktion.
1. Indledning
Studier har dokumenteret, at sæd hyperviskositet (SHV) forekommer i 12-29% af ejakulater . SHV er en tilstand, der kan resultere i mandlig infertilitet , da den alvorligt kan forringe de fysiske og kemiske egenskaber ved sædvæsken . Det er blevet forbundet med nedsat sædmotilitet samt et dårligt resultat af in vitro-befrugtning og øget produktion af reaktive iltarter (ROS). Desuden er der en signifikant korrelation mellem niveauerne af sædets oxidative skadeprodukter og sædvæskens viskositet hos infertile mænd .
Der er stærke indikationer på eksistensen af hæmmende veje, der forringer sædkvaliteten gennem produktion af ROS under transporten af sæd gennem mandens kønsorganer , indikationer på sædskader under laboratoriehåndtering og opbevaring , men også indikationer på yderligere produktion af ROS “automatisk” efter ejakulation, i det mindste i nogle tilfælde af sædets hyperviskositet . Denne tilstand er for det meste forbundet med infektion i mandlige accessoriske kønskirtler og varicocele , selv om patofysiologien stadig ikke er helt forstået. Endvidere blev der påvist nedsat antioxidantkapacitet i sædvæsken i oligoasthenozoospermiske prøver i tilfælde af seminal hyperviskositet . Desuden medfører overdrevent genererede niveauer af ROS lipidperoxidation, der forstyrrer membranens morfologi . Tilstedeværelsen af øgede niveauer af leukocytter i sæd er forbundet med SHV . Desuden er leukocytter en vigtig kilde til ROS og vektorer for retrovirus i sæd, mens deres tilstedeværelse er blevet forbundet med nedsat sandsynlighed for befrugtning samt en lavere succesrate for intrauterin insemination (IUI) og konventionel IVF . Desuden er SHV korreleret med sammensætningen af den seminale mikrobiota og den højere forekomst af patogene bakterier .
Der er blevet foreslået flere terapeutiske tilgange i forbindelse med at reducere viskositeten af SHV-sæd . Overhydrering og prostatamassage var ikke effektive . Sædskånsom aspiration og uddrivelse, gennem en 5-ml sprøjte, er næsten ineffektive, da SHV ikke er et mekanisk fænomen . Proteolyse ved hjælp af chymotrypsin forbedrer håndteringen af hyperviskøs sæd, selv om der forekommer visse ændringer i sædproteinerne . Under hensyntagen til, at en sådan procedure kan beskadige sædets struktur, og at SHV i de fleste tilfælde er korreleret med leukocytospermi , opstillede vi den hypotese, at SHV skyldes neutrofile ekstracellulære fælder (NETs), og at de er følsomme over for DNA-nedbrydning via DNase I. Så vidt vi ved, er dette den første rapport om anvendelse af DNase I med henblik på at behandle SHV.
2. Materialer og metoder
2.1. Deltagere
En prospektiv undersøgelse blev over 3 år gennemført hos patienter med en historie af infertilitet på den medicinske klinik i Athen, Locus Medicus, med følgende udelukkelseskriterier: varicocele hypogonadisme, kryptorchidisme og medfødt obstruktion af sædkanalerne. Der blev udtaget 77 sædprøver med HSV som undersøgelsesgruppe og 62 sædprøver normale med NSV som kontrolgruppe, stratificeret som følger. I første omgang blev et sæt på 32 sædprøver med HSV og 10 sædprøver med NSV behandlet med DNase I. Desuden blev et andet sæt på 26 sædprøver med HSV og 52 sædprøver med NSV behandlet ved hjælp af DGC-metoden (density gradient centrifugation). Endelig blev 19 prøver af HSV behandlet ved en kombination af metoderne, dvs. indledende behandling med DNase I efterfulgt af DGC. Alle deltagere underskrev en formular om informeret samtykke inden enhver involvering.
2.2. Sædanalyse
Sædprøver, der blev udtaget ved onanering efter seksuel afholdenhed i 3-5 dage, blev anbragt i sterile beholdere. Efter opsamling fik sædprøverne lov til at blive flydende ved 37 °C og blev derefter underkastet konventionel analyse sædanalyse referencegrænser, før og efter den kombinerede proces beskrevet ovenfor]. Motiliteten blev vurderet af den samme officielt uddannede (ESHRE) biolog, som ikke er involveret i undersøgelsen. Tilstedeværelsen af hvide blodlegemer (WBC) blev vurderet ved hjælp af peroxidasetest (Leukoscreen FertiPro; Belgien) i overensstemmelse med WHO’s retningslinjer fra 2010 . Selv om viskositeten kunne vurderes ved hjælp af et kvantitativt viskosimeter , blev sædets viskoelasticitet vurderet ved hjælp af engangspipetter af plast, der lod sæden falde ved tyngdekraften, og ved at observere længden af eventuelle tråde . Mænd, hvis sæd har en trådlængde mellem 2 cm og 4 cm, klassificeres som mild SHV (53,12 %); en trådlængde mellem 4 cm og 6 cm (40,62 %) betegnes som moderat SHV; og en trådlængde på mere end 6 cm diagnosticeres som svær SHV (6,25 %) blev inkluderet i gruppen med høj viskositet (HV), mens viskoelasticiteten blev betragtet som normal, når trådlængden var 2 cm eller mindre .
2,3. Behandling med enzym
Den virkning af DNase I blev evalueret i normale og højviskose sædprøver. Efter væskeopløsning blev DNase I forsigtigt trukket ind i den sterile beholder med sædprøven til en slutkoncentration på 20 U/ml og blandet konstant efterfulgt af inkubation ved 37°C i mellem 15 og 60 minutter. Motiliteten og morfologien af ovennævnte sædprøver blev analyseret før og efter enzymatisk fordøjelse, og % PR (motilitet af (a+b) % af det samlede antal spermatozoer) spermatozoer før enhver behandling blev vurderet (dvs. initial % PR).
2.4. Præparation af sæd
Densitetsgradientcentrifugeringsmetoden (DGC) blev udført i overensstemmelse med producentens anbefalinger. Densitetsgradienten fremstilles ved at lægge 1 ml 40 %-medium over 80 %-mediet PureSperm® (Nidacon International, Göteborg, Sverige) i et 15 ml konisk centrifugeringsrør. Sæden blev lagt oven på gradienten og centrifugeret ved 300 g i 20 minutter. Centrifugeringens omfang og kraft kan varieres afhængigt af prøvens kvalitet: f.eks. kan centrifugeringstiden øges for prøver med høj viskositet. Efter centrifugering skal det meste af supernatanten fjernes forsigtigt, og pellet anbringes i et nyt, rent rør og resuspenderes godt i 5 ml medium for at fjerne densitetsgradientmediet. Derefter centrifugeres det ved 200 g i 10 minutter, supernatanten fjernes, og den endelige pellet resuspenderes i det sterile medium til assisterede reproduktionsteknologier (ART). Endelig blev prøver med høj viskositet ved kombinationsbehandling først behandlet med DNase I og derefter forberedt med den ovenfor beskrevne DGC-metode. Koncentration, motilitet og morfologi før og efter præparationen blev bestemt.
Idet blev taget i betragtning, at det samlede antal progressivt bevægelige sædceller (TPMSC) efter vask kunne være nyttigt til at forudsige effektiviteten af intrauterin inseminering, blev udbyttet af hver metode også evalueret på følgende måde: Procentdelen af TPMSC efter behandling enten med DGC-præparationen eller DNase I eller med kombineret DNase I-behandling efterfulgt af DGC-præparationen blev divideret med antallet af samlede sædceller før behandlingen. Desuden blev resultatet af udbyttet (dvs. % endelig PR/samlet antal spermatozoer før) sammenlignet med % oprindelig PR/samlet antal spermatozoer før enhver behandling. Udbyttet blev vurderet i sædprøver med enten høj eller normal viskositet. Selv om der ikke er enighed om antallet af administrerede bevægelige sædceller i ART , er det generelt accepteret, at det er af stor betydning at genvinde det maksimale antal bevægelige sædceller i hver sædprøve efter enhver behandling.
2.5. Statistisk analyse
Data blev analyseret ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Kruskal-Wallis-test med flere sammenligninger ved hjælp af GraphPad Prism 6.0. En p-værdi under 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant.
3. Resultater
Koncentrationen af hvide blodlegemer (WBC) er vist i figur 1. Der er en statistisk signifikant forskel mellem alle grupper (p=0,0238 envejs ANOVA). Desuden er den statistiske forskel inden for HV-gruppen 0,0018.
Koncentration af WBC (106/ml) i overensstemmelse med trådlængden af viskositet (mild, moderat og svær) som HV-gruppen; w/o V: sæd uden viskositet.
Brug af DNase I øger motiliteten af spermatozoer hos mænd (32 forsøgspersoner) med høj viskositet. Som det fremgår af figur 2(a), forbedrer tilsætning af enzym i et kvarter (t=15) procentdelen af (a) bevægelse fra 2,875 % sædceller til 8,094 % sædceller umiddelbart efter væskeopløsning (t=0), hvilket er statistisk signifikant (p=0,049, multipel sammenligningstest). Desuden steg PR-bevægelsen mellem de samme tidspunkter fra 27,468 % til en statistisk signifikant 46,59 % (p<0,0001, multipel sammenligningstest). Samtidig faldt bevægelsen i (c)-fraktionen fra 34,687 % (t=0) til 21,5 % (t=15) (p<0,0001, multipel sammenligningstest), mens bevægelsen i (d)-fraktionen faldt fra 37,812 % (t=0) til 31,968 % (t=15) (p=0,45 multipel sammenligningstest). Anvendelse af DNase I i sæd med normal viskositet øger ikke spermatozoernes motilitet på en statistisk signifikant måde i nogen af prøverne, som det fremgår af figur 2(b).
(a)
(b)
(a)
(b)
Effekter af DNase I på sædmotilitet efter 15 minutters inkubation med DNase I. DNase I forbedrer PR-bevægelsen på en statistisk signifikant måde i hyperviskøs sæd (a), men har ingen virkning i sæd med normal viskositet (b). w/o: sæd uden behandling, behandlet: sæd behandlet med DNase I, a: hurtigt progressive spermatozoer, b: langsomt progressive spermatozoer, c: ikke-progressive, d: immobile, og PR: motilitet af (a+b).
Fortsættelse af inkubation i yderligere femten minutter (hos 21 forsøgspersoner ud af 32) (for en samlet tid på tredive minutter, t=30) øgede motiliteten af en fraktion af spermatozoerne til 9,524 % (t=30) fra 1,761 % (t=0) (p=0,046, multipel sammenligningstest), som vist i figur 3. Interessant nok blev PR-bevægelsen forbedret dramatisk fra 24 % (t=0) til 45,047 % (t=30) (p<0,0001, multipel sammenligningstest) af sædcellerne. Motiliteten af (c) og (d) fraktionen af spermatozoer faldt på en statistisk signifikant måde fra henholdsvis 35,714 % til 22,08 % (p=0,001, multiple sammenligningstest) og fra 40,238 % til 32,238 % (p=0,039, multiple sammenligningstest). Revurdering af sædets viskositet efter DNase I-behandling viste, at viskositeten i de fleste tilfælde er blevet normaliseret eller i det mindste forbedret.
Effekter af DNase I på motiliteten af hyperviskøs sæd efter 30 minutters inkubation med DNase I. DNase I forbedrer en bevægelse på en statistisk signifikant måde i hyperviskøs sæd, men på en mindre spektakulær måde end ved 15 minutters inkubation. w/o: sæd uden behandling, behandlet: sæd behandlet med DNase I, a: hurtigt progressive sædceller, c: ikke-progressive, d: immotile, og PR: motilitet af (a+b).
Vi sammenlignede derefter resultaterne fra sædceller, der gennemgik tæthedsgradientcentrifugering efter DNase I-behandling, med dem, der blev fundet efter tæthedsgradientbehandling alene. På grund af prøvebegrænsninger blev de to procedurer ikke anvendt på prøver ophobet fra de samme forsøgspersoner, men på prøver fra forskellige forsøgspersoner, hvis sædviskositet var høj. Behandlingen med tæthedsgradientcentrifugering blev også anvendt ved intrauterin inseminering (IUI). Som det fremgår af figur 4, steg procentdelen af (a) bevægelse efter tæthedsgradientcentrifugering efter DNase I-behandling fra 3,416 % til 35,083 % af sædcellerne (en 10,27-dobbelt forbedring) sammenlignet med 6,333 % til 26,866 % af sædcellerne (en 4,242-dobbelt forbedring) i tilfælde af tæthedsgradientbehandling alene (p<0,0001, Kruskal-Wallis-test med flere sammenligninger). Med hensyn til (b) bevægelse var forbedringen efter tæthedsgradientcentrifugering efter DNase I-behandling også statistisk signifikant (fra 28,583 % til 40,916 % af sædcellerne (en 1,43-dobbelt stigning), p=0,0112). I behandlingsgruppen med behandling med tæthedsgradientcentrifugering steg den respektive forbedring fra 34,533 % til 46,466 % af spermatozoerne (en 1,34-dobbelt forbedring), selv om forskellen mellem grupperne ikke var statistisk signifikant (ns, Kruskal-Wallis-test ved multipel sammenligning). Endvidere steg PR-bevægelsen i den første gruppe fra 32 % til 76 % af spermatozoerne (2,375 gange) i forhold til en 1,776 gange bedre forbedring i den anden gruppe (fra 40,866 % til 72,666 % af spermatozoerne) (ikke statistisk signifikant mellem grupperne, multipel sammenligning Kruskal-Wallis-test). Motiliteten af (c) og (d) fraktionen af spermatozoer faldt fra henholdsvis 36,083 % til 10,583 % og fra 31,916 % til 13,583 %. Det tilsvarende fald i behandlingsgruppen med behandling med tæthedsgradientcentrifugering alene var fra 29,40 % til 14,80 % (ikke statistisk signifikant mellem grupperne, multipel sammenligning Kruskal-Wallis-test).
Sammenligning mellem DGC efter DNase I-behandling vs. DGC alene i motilitet af hyperviskøs sæd. Den kombinerede behandling havde større indvirkning på sædcellernes bevægelse end DGC alene. w/o: sæd uden behandling, behandlet: sæd behandlet med DNase I, a: hurtigt progressive sædceller, b: langsomt progressive sædceller, c: ikke-progressive, d: immotile, og og og PR: motilitet af (a+b).
Den eftervaskede TPMSC i forhold til det oprindelige antal (udbytte) af hvert præparat blev evalueret (M&M). Udbyttet af tæthedsgradientbehandlingen i tilfælde af et individ uden sædviskositet var 27,096% (figur 5, w/o V-d). Udbyttet af det samme præparat i tilfælde af individer med høj viskositet (figur 5, HV-d) var 18,519 %. Ændringen i begge tilfælde i forhold til deres respektive kontrol (dvs. figur 5, w/o V, HV-d) var statistisk signifikant (henholdsvis p<0,0001 og p=0,0377, multipel sammenligning Kruskal-Wallis-test), hvilket betød, at der gik mange PR-sædceller tabt efter DGC-behandling. Når sædceller fra individer med høj viskositet gennemgik DNase-behandling (figur 5, HV-DNase), var det tilsvarende udbytte 42,47 %, mens sammenligningen mellem tæthedsgradientbehandling (HV-d) og DNase-behandling (HV-DNase) resulterede i en p<0,0001 med hensyn til HV-gruppen, multipel sammenligning Kruskal-Wallis-test. På trods af størrelsen af ovenstående resultat giver kombinationen af DNase-behandling efterfulgt af tæthedsgradientbehandling (figur 5, HV-DNase-d) et resultat på 29,782 % (p=0,0121 i forhold til HV-gruppen, multipel sammenligning Kruskal-Wallis-test). Desuden blev det kombinerede præparat (HV-DNase-d) sammenlignet med % af PR-sædceller i sæd med høj viskositet før enhver behandling (figur 5, HV) og resulterede i p=0,448, hvilket betød, at de fleste af PR-sædcellerne blev genvundet. Desuden er der i sammenligning med w/oV-d-gruppen ingen statistisk signifikant forskel som p=0,619 multipel sammenligning Kruskal-Wallis-test.
Evaluering af udbyttet i % (TPMSC efter behandling/totale spermatozoer før behandling) af DGC, DNase-behandling og kombinationen af dem i sæd med enten høj eller normal viskositet. w/oV-d: sæd med normal viskositet efter DGC, HV-d: sæd med høj viskositet efter DGC, HV-DNase: sæd med høj viskositet efter DNase-behandling, og HV-DNase-d: sæd med høj viskositet efter DNase-behandling efterfulgt af DGC. w/oV: sæd med normal viskositet før behandling; HV: sæd med høj viskositet før behandling.
Dernæst resulterer vurderingen af spermatozoernes morfologi efter et kvarters inkubation med DNase I i en statistisk signifikant stigning i procentdelen af normale spermatozoer fra 5,468 % til 7,25 %, p=0,0197, som illustreret i figur 6. Samtidig faldt hovedanormaliteterne fra 81,75 % til 74,937 % (p=0,0004), mens halsanormaliteterne faldt fra 22,062 % til 19,343 % (p=0,0197). Haleafvigelser og cytoplasmiske dråber følger det samme mønster. Som følge af disse ændringer i morfologien er det rimeligt at observere en stor indvirkning på teratozoospermia-indekset (TZI). Som det fremgår af figur 6, faldt det fra 1,205 til 1,084 (p<0,0001).
Femten minutters inkubation med DNase I strømliner spermatozoernes morfologi og TZI i sæd med høj viskositet. w/o: sæd uden behandling, behandlet: sæd behandlet med DNase I, head abn: abnormiteter i hovedet, tail abn: abnormiteter i halen, og TZI: teratozoospermia index.
4. Diskussion
I denne undersøgelse antog vi, at sædets hyperviskositet stammer fra NET’er. De fremlagte data viser, at det er muligt at fordøje NET’ernes ekstruderede DNA, hvilket fører til en forbedring af spermatozoernes motilitet. Den enzymatiske fordøjelse af DNA fra sædplasma blev undersøgt med henblik på at øge spermatozoernes bevægelighed og dermed gøre dem egnede til brug i ART. Anvendelse af DNase I efter opløsning af sædcellerne resulterede i en forbedring af både motilitet og morfologi af sædcellerne. Der blev anvendt flere inkubationstidspunkter for at opnå de bedste resultater, som blev opnået efter 15 minutters inkubation. Målet med undersøgelsen var at forbedre udbyttet af intrauterin inseminering i kohorten af subfertile mænd, hvis sædceller er karakteriseret ved høj viskositet, sandsynligvis på grund af hindringer forårsaget af ekstruderet DNA. Desuden forbedrede brugen af DNase I den unormale morfologi, som normalt er forbundet med høj viskositet. Spermaberigelsen blev også evalueret i henhold til det endelige antal isolerede, både hurtigt og langsomt progressive spermatozoer.
Den statistisk signifikante forbedring af spermatozoernes morfologi efter behandling med DNase I kan tyde på, at disse abnormiteter materialiserer sig efter ejakulation og opretholdes på grund af høj viskositet. I betragtning af at hyperviskøs sæd har reduceret total antioxidantkapacitet , kan tilstedeværelsen af spermatozoer i dette miljø inducere lipidperoxidation og DNA-skader og i sidste ende morfologisk forringelse . I det mindste nogle af disse morfologiske abnormiteter viste sig at være reversible ved DNase I-behandling. Denne forbedring tyder på optimal anvendelse af ovennævnte behandling i tilfælde, hvor der ikke er så stort et krav om et stort antal direkte motile spermatozoer som ved intrauterin insemination, men hvor der er krav om den bedst mulige morfologi som ved enten IVF eller ICSI-proceduren til befrugtning .
Vores resultater viser, at anvendelse af DNase I kun er effektiv i tilstedeværelse af hyperviskositet. Som det fremgår af figur 2(b), virker anvendelsen af DNase I ikke i fravær af hyperviskositet. Specifikt under normal viskositet og uafhængigt af spermatozoernes motilitet resulterede enzymfordøjelsen ikke i nogen statistisk signifikant forskel i nogen af de undersøgte parametre. I kohorten af hyperviskøs sæd resulterede brugen af enzym derimod i en forbedring af PR-motiliteten på en statistisk signifikant måde, som vist i figur 2(a). Desuden var der ingen forskelle i spermatozoernes motilitet og morfologiske genopretning i HV-gruppen i henhold til svær eller moderat viskositet, selv om antallet af sædprøver med svær viskositet var lavt. Som det fremgår af figur 5, er den statistisk signifikante forskel efter DGC-præparering mellem gruppen med høj viskositet (HV-d) og gruppen med normal viskositet (w/oV-d) desuden 0,0179, hvilket tyder på, at der kan opnås en forbedring. Desuden resulterede udbyttet af den kombinerede behandling (HV-DNase-d) i samme figur i en genvinding af en procentdel PR-sædceller, som nåede niveauet for tilsvarende sædceller hos mænd med høj viskositet (HV) før behandlingen, da den endelige procentdel PR (29,782 %, HV-DNase-d) i det første tilfælde ikke har nogen statistisk forskel fra den oprindelige PR (26,478 %, HV før behandlingen), p=0,4480. Betydningen af denne kombinerede fremgangsmåde, selv om den mindsker udbyttet i forhold til DNase-behandling alene (p<0001 mellem HV-d og HV-DNase), blev underbygget af, at tæthedsgradientbehandlingen trak modstykker til genvundne, (c) og (d) klasse sædceller fra, hvorved de blev oprenset. Derimod var den tilsvarende statistiske forskel mellem udbyttet af DGC-præparatet (HV-d, 18,519 %) og “HV før behandling” (26,478 %) signifikant (dvs. p=0,0322).
Dertil kommer, at det kunne erstatte den mekaniske behandling af hyperviskøs sæd; det er således almindeligt, at det fortyndes eller trækkes ind i en hypodermisk nål og tvinges igennem for at overvinde den forhøjede viskositet. Selv om disse metoder sandsynligvis ikke er effektive, fordi denne form for behandling øger ROS-produktionen . Endvidere er hyperviskositet negativt korreleret med kromatinintegritet som defekt dekondensation, hvilket allerede er blevet bemærket .
Generelt er anvendelsen af DNase I i luftvejene allerede blevet medicinsk godkendt af FDA i tilfælde af cystisk fibrose . Endvidere er DNase en naturlig bestanddel af sædplasma, hvis rolle sandsynligvis er fortynding af NET’er, der dannes i det kvindelige reproduktionsspor efter rekruttering af neutrofile som reaktion på inflammation, og den foreslåede procedure er potentielt medicinsk anvendelig i ART. Dens rolle forstærkes også af, at dens fravær har negative virkninger på inseminationen hos primater.
Hyperviskositet er sandsynligvis forårsaget enten af inflammation eller af en dysfunktion i sædkirtlerne, selv om den nøjagtige mekanisme ikke er klar. Det kan være forbundet med virusinfektioner i kønsorganerne, som tidligere påvist af vores laboratorium . Flere terapeutiske protokoller er blevet anvendt med henblik på at reducere sædets viskositet, men resultaterne har sjældent været opmuntrende . Metoder som f.eks. overhydrering og prostatamassage har ikke givet de forventede resultater. Anvendelse af proteolytiske enzymer som f.eks. alfa-chymotrypsin gav håbefulde resultater, men brugen heraf er ikke blevet vedtaget .
I en anden undersøgelse blev DNase I anvendt til at mindske viskositeten, men de endelige resultater var ikke vellykkede i denne henseende . Forfatterne undersøgte ikke kvalitative sædparametre, dvs. motilitet. Desuden var inkubationstiden meget højere (en time) end den, vi foreslog (femten minutter), så den neutrale virkning på viskositeten kunne muligvis tilskrives den forlængede inkubation af enzymet med sædplasmaet.
Endeligt, på trods af dataene om, at sædets hyperviskositet er blevet korreleret med betændelse i de mandlige kønsorganer, dvs, sædblærerne, hvilket har ført til brug af antibiotika og antioxidanter, kunne disse terapiformer kun behandle denne tilstand i de tilfælde, hvor hovedfaktoren var inflammation. Normalt er den forårsaget af forskellige faktorer, der virker synergistisk, og derfor findes der ingen direkte årsagsterapi for hyperviskositet .
Når de udsættes for inflammatoriske stimuli, udøver neutrofiler, den vigtigste leukocytpopulation i sæd, deres beskyttende rolle via inaktivering af bakterier ved fagocytose og efterfølgende aflivning gennem udsættelse for proteolytiske enzymer og ROS. En anden virkningsmåde, hvormed neutrofiler kan neutralisere patogener, er gennem produktion af neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er) . NET’er er tredimensionelle fibrøse netværk, der hovedsagelig består af kromatin, som kan fange og fastholde mikroorganismer. NET’er har vist sig at være følsomme over for DNase, men ikke over for protease-nedbrydning . Da dannelsen af NET’er er DNA-baseret, og da seminal DNase har vist sig at fordøje ekstruderet DNA og frigøre indfiltrede spermatozoer, antog vi, at brugen af eksogen DNase kunne vise sig at være en værdifuld behandling i tilfælde af seminal hyperviskositet hovedsagelig forårsaget af tilstedeværelsen af ekstracellulært, eksponeret neutrofilt DNA.
Fra patofysiologisk synspunkt er det koncept, der tilskriver hyperviskositet til inflammation, næsten blevet etableret. De inflammatoriske reaktioner omfatter dannelse af NET’er fra neutrofiler med henblik på indfangning af mikroorganismer. Det er meget sandsynligt, at spermatozoerne bruger meget energi på at forsøge at frigøre sig fra NETs, og derfor er undersøgelsen af deres oxidations- og apoptotiske status af stor betydning. Desuden er den “fangeeffekt”, som allerede er blevet beskrevet, en konsekvens af spermatozoernes bevægeforebyggelse på grund af deres indfiltring i NETs.
I denne undersøgelse forsøgte vi at lyse det ekstracellulære DNA i sædplasma, som er den vigtigste komponent i NETs, med DNase I med henblik på at frigøre dem fra NETs og genvinde spermatozoernes kvalitetsparametre, dvs. motilitet og morfologi. Desuden er der, som det fremgår af figur 1, en statistisk signifikant forskel mellem koncentrationen af WBC og viskositetsgraden. Den foreslåede behandling er begrænset til postjakulationsfasen og ikke til den kliniske fase. Desuden blev den oprindelige hypotese om, at den øgede viskositet af sædcellerne var et resultat af tilstedeværelsen af DNA i sæden, verificeret, selv om der er behov for yderligere undersøgelser for at bekræfte denne hypotese. I betragtning af at rekrutterede neutrofiler danner NET’er til betændte steder, opstillede vi den hypotese, at DNA’et i sæden stammer fra neutrofiler. Selv om vi ikke har fremlagt et direkte bevis, der understøtter denne antagelse, mener vi, at den vigtigste mulige kilde til DNA ifølge vores viden er neutrofil kromatin, som ekstruderes under inflammation.
5. Konklusioner
Vores undersøgelsesresultater understøtter konklusionen om, at DNase I-behandling giver en statistisk signifikant forbedring af sædmotilitet og morfologi. Det forbedrer de grundlæggende sædparametre for ART, dvs. motilitet og morfologi, kun i tilfælde af hyperviskøs sæd. Desuden tyder vores resultater på, at en hovedårsag til SHV er dannelsen af NET’er, og vi foreslår således det terapeutiske potentiale og nytten af denne tilgang.
Datatilgængelighed
De data, der er anvendt til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, er tilgængelige fra den tilsvarende forfatter efter anmodning.
Etisk godkendelse
Alle procedurer, der blev udført i denne undersøgelse og involverede menneskelige deltagere, var i overensstemmelse med de etiske standarder fra Bioethics and Deontology Commission, National Kapodistrian University of Athens, Faculty of Medicine, godkendt i januar 2014 (referencenummer: 1130).
Samtykke
Alle patienter gav deres informerede samtykke forud for deres deltagelse i undersøgelsen.
Interessekonflikter
Alle forfattere erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Autors bidrag
Angelos D. Gritzapis og Vassilis Tsilivakos udtænkte undersøgelsen. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis og Vassilis Tsilivakos udførte indsamlingen af data, deltog i udformningen og udfærdigede manuskriptet. Effrosyni Nosi udførte immunoassaysene, og Angelos D. Gritzapis udførte den statistiske analyse. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis, Konstantinos Makarounis, Georgios Georgoulias, Vasilios Kapetanios, Christodoulos Papanikopoulos, Anastasia Konstantinidou, Panagiotis Venieratos, Marighoula Varla-Leftherioti og Vassilis Tsilivakos har deltaget i analysen og fortolkningen af data. Alle forfattere læste og godkendte den endelige version af manuskriptet.
Anerkendelser
Dette projekt blev finansieret af det klinisk diagnostiske laboratorium, Locus Medicus S.A.