Fertilt afkom fra sterile kønskromosomiske trisomiske mus
Trisomiske dyr mister tredje kromosom
Når et tredje kønskromosom tilføjes til de normale to hos pattedyr (XX for hunner og XY for hanner), opstår der generelt udviklingsfejl. Mus, der er trisomiske med hensyn til kønskromosomer, er ufrugtbare. Hirota et al. viser, at omprogrammering af celler fra sterile mus med kromosomtrisomier XXY eller XYYY genererer XY-stamceller. Sædceller genereret fra disse XY-stamceller kan give anledning til sunde, fertile afkom. Omprogrammering fremmede også tab af det ekstra kromosom i celler fra patienter med Klinefelter (XXY) eller Downs syndrom (trisomi 21).
Science, dette nummer s. 932
Abstract
Det er afgørende for normal udvikling og sundhed at have det korrekte antal kromosomer. Kønskromosomtrisomi rammer 0,1 % af den menneskelige befolkning og er forbundet med infertilitet. Vi viser, at under reprogrammering til inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) mister fibroblaster fra sterile trisomiske XXY- og XYY-mus det ekstra kønskromosom gennem et fænomen, som vi kalder trisomibaseret kromosomtab (TCL). De resulterende euploide XY iPSC’er kan differentieres til den mandlige kimcellelinje og funktionelle sædceller, der kan anvendes ved intracytoplasmisk sædinjektion for at producere kromosomalt normale, fertile afkom. Tab af kønskromosomer er forholdsvis sjældent under generering af XX- og XY-iPSC’er i mus. TCL anvendes også på andre kromosomer, idet der genereres euploide iPSC’er fra celler fra en musemodel med Downs syndrom. Det kan også skabe euploide iPSC’er fra fibroblaster fra humane trisomiske patientfibroblaster. Resultaterne har relevans for overvindelse af infertilitet og andre trisomiske fænotyper.
Pattedyrenes kønskromosomer har specialiserede roller i mandlig (XY) og kvindelig (XX) kønscelleudvikling (1). Kønskromosomanomale abnormiteter er den mest almindelige genetiske årsag til menneskelig infertilitet (2). Ved kønskromosomtrisomier (SCT’er) Klinefelter (XXY) og dobbelt Y (XYY) syndromet er spermatogenesen forstyrret af henholdsvis overskydende X- og Y-gener (2). XYY-mænd er almindeligvis fertile på grund af spontant tab af det ekstra kønskromosom (mosaikisme). Hos XXY-mænd er mosaikisme mindre almindeligt. Hævning af testikulær sæd har muliggjort reproduktion hos nogle unge Klinefelter-mænd, men er mindre vellykket hos ældre patienter (3, 4). XXY- og XYYY-individer uden XY-kimceller er infertile.
For at studere SCT-infertilitet genererede vi voksne XXY- og XYYY-mus, der bærer de fluorescerende reportertransgener Blimp1-mVenus (BV) og Stella-ECFP (SC) (5) for at overvåge differentiering af pluripotente stamceller til primordiale kimcellelignende celler (PGCLC’er) (6). XXY-hanner blev skabt ved at parre en wild-type hun med en kønskromosomvariant han, der producerer XY-holdige sædceller (fig. S1). Generering af XYY-mus kræver arv af et Y-kromosom fra begge forældre. Vi brugte derfor et faderligt nedarvet wild-type Y-kromosom og et moderligt nedarvet Yd1-kromosom, der ikke udtrykker den testikelbestemmende Sry (fig. S1) (7) (7). Som tidligere vist (8, 9) rekapitulerede spermatogenesefænotypen i begge modeller den i SCT-mænd, med stop på prospermatogoniale stadie i XXY-mus og ved pachynema i XYY-mus (fig. S2). Spermatogenese var normal i euploide XY BVSC transgene søskende.
Næst etablerede vi fibroblaster fra SCT- og kontrol XY- og XX-mus (Fig. 1A). DNA- fluorescens in situ hybridisering (DNA-FISH) for X-genet Slx og Y-genet Sly bekræftede, at passage 4 (P4) SCT- og kontrolfibroblaster havde bevaret deres oprindelige kønskromosomkomplementer (Fig. 1B og fig. S3A). Fibroblaster blev omprogrammeret til inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) (10) på en doxycyclin (Dox)-inducerbar måde. DNA-FISH blev udført i resulterende P2 iPSC’er (fig. 1A).
(A) Eksperimentelt skema til generering af XXY-, XYY-, XY- og XX iPSC’er. 2i, inhibitorer af GSK3ß og Mek1/2; LIF, leukæmihæmmende faktor. (B til D) Slx (grøn) og Sly (magenta) DNA-FISH af (B) fibroblaster og P2 iPSC’er fra XXY- og XYY-mus (n = 50 celler). Skalaer, 5 μm. (E) P2 iPSC-kønskromosomkomplementer. Hver søjle repræsenterer en iPSC-linje og procentdelen af celler, der udviser hvert supplement (n = 50 celler pr. linje). Tallene i parentes viser antallet af undersøgte iPSC-linjer. Data for to dyr kombineret.
En høj andel af SCT-afledte iPSC-linjer udviste tab af kønskromosomer. Fra XXY-mus observerede vi XY-, XX- og XO-IPSC’er (Fig. 1, C og E). Forekomsten af tab var ens for X- og Y-kromosomer (P = 0,062, Mann-Whitney-test). Fra XYY-mus observerede vi XY- og XO-IPSC’er (Fig. 1, D og E). Y-kromosomtab hos XYY-hanner skete med en lignende hyppighed som den, der blev observeret for X- og Y-kromosomet kombineret hos XXY-hanner (P = 0,089, Mann-Whitney-test). Vi sammenlignede derefter forekomsten af kønskromosomtab mellem SCT-afledte og euploide XY- og XX-afledte iPSC’er. Kønskromosomtab var mere almindeligt i SCT- end euploid-afledte iPSC’er (Fig. 1E), uanset den cutoff, der blev anvendt til at definere kønskromosomtab (fig. S12D).
Kønskromosomtab kunne forekomme under reprogrammering af SCT-celler eller under iPSC-opformering til P2, hvilket måske giver en proliferativ fordel til resulterende euploide celler. Faktisk er kønskromosom ustabilitet blevet observeret i pluripotente stamceller (11, 12). For at teste den sidstnævnte hypotese analyserede vi kønskromosomstabilitet mellem P2 og P6 i iPSC’er med meget parental (>90%) komplementer (fig. S4A). Vi observerede tab af kønskromosomer i XX- og XXY iPSC-linjer (P < 0,01 og 0,05, henholdsvis; Wilcoxon signed-rank test), men ikke i XY- og XYYY iPSC-linjer (P = 0,21 og 0,66, henholdsvis; Wilcoxon signed-rank test). Ingen iPSC-linje viste imidlertid mere end et fald på 15 % i forældrekomplementet (fig. S4B). Desuden var kønskromosometabet mellem P2 og P6 ikke trisomibaseret (fig. S4B). SCT-afledte euploide XY iPSC’er udviste heller ingen proliferativ fordel i forhold til XXY- eller XYYY iPSC’er (fig. S5). Da SCT-fibroblaster også var karyotypisk stabile (fig. 1B og fig. S3A), er kromosomtab sandsynligvis induceret under iPSC-reprogrammering og er således forskellig fra kønskromosominstabilitet i pluripotente stamceller (11, 12). Vi refererer til fænomenet som trisomibaseret kromosomtab (TCL).
Vi bestemte derefter, om euploide XY iPSC’er afledt af SCT fibroblaster ville danne funktionelle sædceller. Vi udvalgte meget euploide (≥80% af cellerne XY) P6 iPSC’er, der er tilpasset Dox-fri medium (fig. S6). Til vores XYYY-eksperimenter blev kun XY iPSC-linjer, der bevarede wild-type Y-kromosomet snarere end Yd1-kromosomet, anvendt til PGCLC-eksperimenter (fig. S7). Karyotyping bekræftede, at alle SCT-afledte XY iPSC-linjer og en kontrol XY iPSC-linje var euploide (fig. S8). Disse iPSC-linjer blev differentieret (6) gennem en epiblastlignende tilstand for at skabe PGCLC-aggregater, der var positive for BV og SC (fig. 2A). BV-positive PGCLC’er (tabel S1) blev isoleret ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) (Fig. 2B) og transplanteret i kimcellede W/Wv (Kit-mutant) testikler (13).
Spermatogenese i recipienter blev evalueret 9 til 10 uger efter transplantation. Teratomer, som observeres efter iPSC-afledt PGCLC-transplantation (6), var til stede i 29% af XXY-afledte og 50% af XYY-afledte transplanterede linjer (fig. S9). Genoprettelse af spermatogenese, afsløret ved tilstedeværelsen af spermatogene kolonier (fig. 2C) og ved histologi (fig. 2D), blev observeret for alle XXY- og XYYY-afledte iPSC-linjer, der blev anvendt (tabel 1). SCT-afledte XYY iPSC’er kan således differentiere sig til kønsceller in vitro og fuldføre spermatogenese efter transplantation.
- Se popup
- Se inline
Vi spurgte, om sædceller skabt via transplantation kunne understøtte reproduktion. Intracytoplasmisk sædinjektion (ICSI) ved hjælp af sæd fra to XXY- og to XYYY-afledte XY iPSC-linjer (fig. 2E og fig. S10A) genererede zygoter, der udviklede sig til tocellede embryoner in vitro (effektivitet 76.7 til 87,3 %) (Fig. 2F, fig. S10B og tabel S2) og groft normale afkom, når de blev transplanteret til recipienter (effektivitet 46,9 til 59,4 %) (Fig. 2G, fig. S10C og tabel S2). Polymerasekædereaktionsgenotypering bekræftede, at afkommet var afledt af de transplanterede PGCLC’er (fig. S10D). Ungerne fra XXY- og XYYY-afledte iPSC-linjer viste en sammenlignelig vækst med dem, der var afledt af kontrol-XY iPSC’er (fig. S10E). Navnlig havde de XXY- og XYYY-afledte hvalpe euploide (XY eller XX) komplementer (fig. S11). Tre modne hanner og tre hunner fra hver XXY- og XYYY-afledt iPSC-linje blev parret med hinanden, og alle var fertile (fig. 2H og fig. S10F). Således giver sædceller fra SCT-afledte XYY iPSC’er anledning til kromosomalt normale, sunde og fertile afkom.
Vi undersøgte, om TCL er specifik for trisomi af kønskromosomer. Da musemodeller med trisomi for et komplet autosom ikke er tilgængelige (14), gentog vi vores eksperimenter i hanmus Tc1 transchromosomiske mus, en Downs syndrommodel med et accessorisk humant kromosom 21 (hChr.21) (15). Tc1-mus bærer en hChr.21-indsat neomycinresistenskassette, og udvælgelse for denne reducerer hChr.21-mosaikisme (15). Vi berigede derfor først voksne Tc1-fibroblaster for tilstedeværelsen af hChr.21 ved hjælp af neomycin-analogen G418 (Fig. 3A). DNA-FISH viste, at langt størstedelen (≥96 %) af Tc1-fibroblaster bevarede hChr.21 (Fig. 3B og fig. S3B). Disse Tc1 fibroblaster blev reprogrammeret uden G418-selektion, og de resulterende iPSC’er blev analyseret ved P2. Ti af de 16 iPSC-linjer, der blev genereret (62,5 %), viste tab af hChr.21 i ≥10 % af cellerne (fig. 3, C og D, og fig. S12D). I modsætning hertil blev hChr21 efter fjernelse af G418 bevaret i Tc1-fibroblaster, der var dyrket i samme periode som den, der blev anvendt til iPSC-reprogrammering (18 dage), og i P6 iPSC-linjer, der havde meget parentale (>90% hChr.21-positive) komplementer ved P2 (fig. S12, A og B). Vi konkluderer, at tabet af hChr.21 i Tc1-celler fremmes af reprogrammering snarere end af G418-fjernelse, og at TCL derfor også påvirker et accessorisk kromosom.
(A) Eksperimentelt skema til generering af Tc1 iPSC’er. (B og C) Slx (grøn) og hChr.21 (magenta) DNA-FISH af (B) fibroblaster og (C) P2 iPSC’er fra Tc1-mus (n = 50 celler). Skalaer, 5 μm. (D) P2 iPSC-kromosomale komplementer. Hver søjle repræsenterer en iPSC-linje og procentdelen af celler, der udviser hvert supplement (n = 50 celler pr. linje). Tallene i parentes viser antallet af undersøgte iPSC-linjer. Data for to dyr kombineret.
Vi spurgte dernæst, om TCL forekommer i menneskelige celler. Tilfælde af kromosomtab er blevet observeret under human trisomisk cellekultur (16, 17), men dets prævalens og forholdet til reprogrammering er ikke blevet systematisk analyseret. Vi udvalgte humane Klinefelter syndrom, Down syndrom og euploide XY og XX fibroblastlinjer, der udviser minimal mosaikisme (fig. S13, A og D), omprogrammerede dem og bestemte kromosomkomplementerne af de resulterende iPSC-linjer. Vi observerede XY- og XX-IPSC’er fra fibroblaster med Klinefelters syndrom og euploide iPSC’er fra fibroblaster med Downs syndrom (fig. S13, B, C, F og G). Kromosometab var mere almindeligt i trisomiske end i disomiske celler, hvilket viser, at TCL også forekommer under human reprogrammering. Hyppigheden af meget euploide iPSC-linjer var imidlertid lavere end den, der blev observeret i trisomi-afledte mus iPSC’er (fig. S13, F til H).
Vi har vist, at TCL producerer euploide iPSC’er fra SCT og autosomale trisomiske mus og patienter (fig. S12E). I mus kan de resulterende “korrigerede” iPSC’er danne funktionelle sædceller, hvilket muliggør produktion af kromosomalt euploide afkom fra infertile SCT-individer. TCL supplerer eksisterende iPSC-terapier for kromosomafvigelser (17-21). De mekanismer, der forårsager TCL, er ukendte. Cellulære belastninger i forbindelse med reprogrammering kan selektere mod trisomiske celler og muliggøre fremkomsten af euploide celler. Vi observerede mindre hyppige TCL i humane end i museceller (fig. S12D og S13H). Selv om TCL er sjældne, kunne TCL tilbyde behandlinger til infertile SCT-patienter, for hvem alternative tilgange er mislykkedes. Den kliniske anvendelse af menneskelige kønsceller fremstillet in vitro bør imidlertid nøje overvejes etisk og juridisk (22-24). Desuden skal der udvikles fuldstændig in vitro-sæddannelse for at undgå risikoen for teratomdannelse som følge af kimcelletransplantation.
TCL gør det også muligt at fremstille kvindelige iPSC’er fra mænd, hvilket giver potentiale for genetisk dissektion af kønsdimorfismer (25). Ved at skabe isogene iPSC-linjer, der kun adskiller sig med hensyn til deres kønskromosomer, kan kønsforskelle, der identificeres under iPSC-sygdomsmodellering, tilskrives X- eller Y-kromosomale virkninger.
Supplementært materiale
Materialer og metoder
Figurer. S1 til S13
Tabeller S1 til S3
Referencer (26-34)
Dette er en artikel distribueret i henhold til vilkårene i Science Journals Default License.