Materialer og metoder

Prøveindsamling

Deltagere på 18 år og derover blev inviteret til at deltage i undersøgelsen via e-mail og annoncer på opslagstavler på University of British Columbia, Vancouver BC. Deltagerne blev bedt om at aflevere prøver ved hjælp af tørre, låste mundvabler (Puritan PurFlock, Fisher Scientific, Waltham MA) og svampede mundvabler (Oragene ORAcollect, DNA Genotek, Ottawa, ON) ved hjælp af selvvejledte instruktioner; rækkefølgen, i hvilken disse prøver blev afleveret, var computertilfældet. En forskningsassistent var til stede under prøveudtagningen for at besvare spørgsmål, som deltagerne havde vedrørende instruktionerne for prøveudtagning. Alle prøver blev opbevaret ved stuetemperatur. Farmakogenetiske rapporter blev ikke udleveret til deltagerne, da dette ikke var inden for rammerne af denne undersøgelse.

DNA-udtræk

DNA blev ekstraheret ved hjælp af Ambion MagMAX perlebaseret DNA-udtrækssæt (Applied Biosystems, Foster City, CA) i henhold til producentens instruktioner. DNA blev ekstraheret 3 dage efter prøveudtagningen og elueret i 60 µl. DNA-mængde og -kvalitet blev vurderet ved hjælp af Qubit 2.0 fluorescensassay (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). Prøvernes renhed blev bestemt ved hjælp af værdierne for optisk tæthed A260/280 (ODA260/280) ved hjælp af NanoVue-spektrofotometeret.

Genotypebestemmelse

Genotypebestemmelse blev udført på QuantStudio 12K Flex-instrumentet til kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) (LifeTechnologies, Carlsbad, CA) på assays, der er valideret af producenten (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). Indholdet af analyserne omfattede 28 SNP’er, der påvirker lægemiddelresponset på OpenArray-platformen (se Yderligere fil 2) og et CYP2D6 CNV TaqMan-assay (Assay ID: Hs_000100000101_cn). For at validere assays blev 44 DNA-kontroller fra National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), Human Genetic Cell Repository på Coriell Institute for Medical Research genotypet. Overensstemmelsen af kald blev bekræftet med den forventede genotype. Desuden blev resultaterne bekræftet ved Sanger-sekventering af kontrol-DNA’et. For hver kørsel blev deltagerprøverne kørt i dubletter på OpenArray og firdobbelt på CNV-assayet sammen med Corriell DNA-prøver, der blev anvendt som positive kontroller og ingen skabelonkontrol (NTC’er).

Statistisk analyse

TaqMan Genotyper software v1.3.1 (Applied Biosystems) blev anvendt til at bestemme SNP-genotyperingskaldetallet på OpenArray. Genotypeopkaldsraten blev beregnet for hvert OpenArray-assay ved at dividere det samlede antal genotyper, der blev tildelt med succes, med det samlede antal forsøg på genotypetildeling.

For CNV TaqMan-assayet blev CopyCaller v2.1-software (Applied Biosystems, Foster City, CA) anvendt til at tildele CYP2D6-kopienummeropkald og CNV-tillidsscore. DNA-prøver blev tildelt et diploidt kopieringsnummer af vild type, og kopieringsnummervariation (deletions- eller duplikationshændelser) blev grupperet i henholdsvis 2N- og CNV-grupperne. Der blev fastsat en 95 % genotyping call rate og en 95 % konfidensscore for henholdsvis SNP- og CNV-genotypingsresultater. Der blev beregnet en Student’s t-test med to stikprøver under antagelse af ulige varianser for at bestemme den signifikante forskel mellem DNA-udbyttet, renheden og call-raterne fra de forskellige DNA-typer i parvis. Genotypningsopgaverne, der blev genereret fra DNA-prøvetypen (svampespidset vs. tørflocked) fra den samme deltager, blev sammenlignet for at beregne overensstemmelse.

Resultater

Treenogtredive deltagere blev rekrutteret og indsamlede svampespidsede svaberprøver og tørflockede svaberprøver. Deltagerne fandt de selvvejledte instruktioner til indsamling ligetil og nemme at følge for begge typer svaberprøver. Deltagerne rejste spørgsmål om det nødvendige tryk til gnidning af vatpindene og om den korrekte placering af vatpindene i munden. Deltagernes kommentarer om de to vatpinde var ens, idet nogle foretrak vatpinde med svampespids og andre foretrak de tørre, fastsiddende vatpinde; der var ikke enighed om en mening.

Der var en signifikant forskel i det gennemsnitlige DNA-udbytte mellem DNA indsamlet ved hjælp af tørre, fastsiddende vatpinde og vatpinde med svampespids (0,26 ± 0,34 µg vs. 1,91 ± 1,44 µg p = 4,4 × 10-7; tabel 1). Den gennemsnitlige DNA-renhed på tværs af alle indsamlingstyper lå inden for det accepterede område for rent DNA (gennemsnit (SD)) 1,72(0,78) og 1,85(0,39) for henholdsvis tørre svaberprøver og svampetapede svaberprøver.

Der var tre prøver indsamlet fra svampeklippede svaberprøver, der havde lave DNA-koncentrationer (< 5 ng/µl). Disse tre prøver havde 100 % genotyping call-rater på OpenArray og 100 % CNV-konfidensscorer (fig. 1). Omvendt havde en af prøverne, der havde en DNA-koncentration på 79 ng/µl, den laveste OpenArray-kaldningsrate (18 %). De højeste call-rater på OpenArray (> 95 %) for tørre, flockede svaberprøver blev observeret for syv prøver med en koncentration på mellem 1,2 og 8,9 ng/µl (fig. 1a). De højeste CNV-konfidensopkald (> 95 %) blev observeret for prøver med en koncentration på mellem 1,0 og 24,4 ng/µl (fig. 1b).

For alle assays på OpenArrayet, DNA-prøver indsamlet fra svampede svaberprøver resulterede i generelt højere genotypekaldsrater (97 %) sammenlignet med tørre svaberprøver (54 %) (Fig. 2). Med et ekstra trin med en 0,5 × fortynding af ekstraheret DNA havde svampesvampene en konsistent genotyping call rate > 95 %. Prøveopkaldsraten på OpenArray varierede fra person til person, idet 29(93,5 %) deltagere havde prøveopkaldsrater > 95 % fra DNA fra svampetapede vatpinde og 4(12,9 %) havde prøveopkaldsrater > 95 % fra DNA fra tørre, flockede vatpinde. Der blev observeret en overensstemmelse på 94 % med succesfulde genotypebestemmelser mellem svampetapede svaberprøver og tørre svaberprøver indsamlet fra den samme person.

Copy number calls for CYP2D6 blev tildelt 2(6,5 %) af prøverne fra svampespidsede svaberprøver med en samlet tillidsscore på 0,99. Til sammenligning blev der tildelt 8(25,8 %) af prøverne fra tørre, flækkede svaberprøver til kopiantalopkald med en samlet tillidsscore på 0,91 (se Yderligere fil 3).

Diskussion

Sigtet med denne forskning er at hjælpe investigatorer og virksomheder med at identificere en optimal indsamlingsmetode, der giver DNA af høj kvalitet til genotypebestemmelse. Denne undersøgelse giver nye oplysninger om DNA-kvaliteten for to typer svaberprøver, som var høj (defineret som ODA260/A280 1,8), selv om der var en betydelig forskel i DNA-udbyttet (p-værdi = 4,4-7). På OpenArray-platformen havde svampetapede svaberprøver den højeste samlede genotyping call-rate (97 % vs. 54 %) og den højeste konfidensscore for CYP2D6 CNV TaqMan Assay (0,99 vs. 0,91). En > 95% SNP-genotyping call rate anses for at afspejle data af acceptabel kvalitet, og CNV konfidensscore på 99% anses for at være af høj kvalitet .

En DNA-prøve isoleret fra svampetapet vatpind havde en call rate på under 95%. I rutinemæssig laboratoriepraksis ville prøver med lave call rates blive genindsamlet på grund af ufuldstændige resultater til patientrapporter. Ved at udelade denne prøve steg den samlede genotypingskaldprocent til 99,5 % for svampetapede vatpinde.

CYP2D6 CNV-resultater viste en stigning i CNV-tildelinger for DNA indsamlet fra tørre, flockede vatpinde 8(25,8 %) sammenlignet med svampetapede vatpinde 2(6,5 %). Et højere antal CNV-tilknytninger korrelerede med lavere tillidsscore. Størstedelen af deltagerne 30(97 %) var i stand til at indsamle prøver, der resulterede i høje genotypingskaldrater for svampetapede vatpinde, mens kun få personer 4(13 %) var i stand til at indsamle prøver med høje kaldrater for begge typer af vatpinde. Det kan konkluderes, at svampesvaberprøver var acceptable for patienterne og gav DNA af god kvalitet med et tilstrækkeligt udbytte til qPCR-baseret farmakogenetisk testning.