Matematisk karakterisering af dynamikken i TA

Dynamikken i TA er dikteret af, hvordan dens komponenter er rumligt og tidsmæssigt organiseret på promotoren. Da TA kan antage mange forskellige konfigurationstilstande, og tilstandsudviklingen i det væsentlige er stokastisk og involverer mange molekyler og komplekse interaktioner, anvender vi teorier om statistik og sandsynlighed til at undersøge TA’s dynamik. For enkelhedens skyld antager vi, at koncentrationerne af transkriptionsassocierede arter som f.eks. GTF’er forbliver konstante omkring modelgenet, og at de molekylære interaktioner, der involverer promotoren, er i dynamisk ligevægt. Udtrykket “dynamisk ligevægt” betyder ikke, at alle molekylære interaktioner er reversible; det kræver snarere blot, at TA’en efter et stykke tid skal genfinde sin nuværende tilstand. Et modelgen og alle de arter, der findes omkring det, udgør et system. Ovenstående forudsætninger indebærer, at et sådant system befinder sig i en stabil tilstand. Lad os betragte et statistisk ensemble bestående af et stort antal af sådanne i alt væsentligt identiske systemer, som hver især udvikler sig uafhængigt af hinanden. Antallet af systemer er stort nok til, at alle mulige konfigurationstilstande i TA’en kan dækkes af dette ensemble. Det vil sige, at hver tilstand, som et enkelt gen gennemgår, kortlægger tilstande for andre gener i ensemblet, og andelen af gener i en særlig tilstand X (f.eks. gener, hvis enhancere er bundet af aktivatorer), P(X), forbliver konstant over tid. Tilsvarende, hvis et individuelt gen observeres på et hvilket som helst tidspunkt, er sandsynligheden for, at genet befinder sig i tilstanden X, også P(X). I denne forstand er det en tilfældig begivenhed, hvilken tilstand et individuelt gen befinder sig i.

For den minimale model (fig. 1a) definerer vi alle konfigurationstilstande i TA’en som et universelt sæt Ω og de forskellige tilstande med de samme hovedtræk som henholdsvis følgende delmængder (fig. 1b). A angiver, at forstærkeren er bundet af en aktivator. S angiver, at kernepromotoren er bundet af proteinerne i SCF. M angiver, at et nascent mRNA er i gestation (herunder processen fra PIC-dannelse til Pol II’s flugt ind i elongation). J angiver, at den enhancer-bundne aktivator er forbundet med SCF, PIC eller OPC gennem Mediator. Da eukaryote transkriptionel initiering kræver tilstedeværelsen af SCF på kernepromotoren4,12, er M⊂S. I henhold til definitionerne er J⊂AS. I sættet MJ er M og A samtidige, dvs. at de enhancerbundne aktivatorer kan påvirke Pol II’s virkning direkte gennem Mediator. Således beskrives den transkriptionelle initiering under direkte regulering af aktivatorer af sættet MJ, mens den basale, aktivatoruafhængige transkriptionelle initiering er omfattet af sættet M-J. Sandsynligheden for et nascent mRNA i svangerskab, dvs. sandsynligheden for, at der dannes et mRNA, er

hvor q er en konstant, der repræsenterer den basale transkriptionelle initiering, og Aj er en delmængde af A (se S1 i Supplerende oplysninger for nærmere oplysninger). I Aj er de enhancer-bundne aktivatorer forpligtet til at kontakte den SCF-, PIC- eller OPC-tilknyttede Mediator. Ligning (1) karakteriserer forholdet mellem mRNA-produktion og TA’s dynamiske egenskaber.

Kodning af koncentrationen af transkriptionelle aktivatorer

I forbindelse med forskellige arkitekturer af promotor-kromatin i forskellige transkriptionelle stadier kan de enhancer-bundne aktivatorer udføre forskellige funktioner, såsom fremme af histonacetylering og rekruttering af GTF’er4,5,15. Specifikt omfatter sættet Aj de enhancer-bundne aktivatorer, der er ansvarlige for håndtering af det basale transkriptionelle maskineri og styring af transkriptionel initiering. Desuden er aktiviteterne af disse aktivatorer også forbundet med kodningen af den nukleare koncentration af aktivatorer, for er den eneste faktor i ligning (1), der afhænger af aktivatorkoncentrationen. Her undersøger vi dynamikken af sådanne aktivatorer.

Aktivatorer bevæger sig hurtigt i kernen, og sandsynligheden for, at de når frem til forstærkeren, er proportional med deres nukleare overflod9. Lad os betragte en tidsperiode, hvor de aktivatorer, der er involveret i sættet Aj, binder sig til og derefter forlader enhanceren i m (m = 1, 2, 3, …) cyklusser. Vi definerer den tidsmæssige belægningsgrad RTOR for disse aktivatorer som , hvor og angiver henholdsvis bindings- og afbindingstiden i den j-te cyklus. For det faste antal na af aktivatorer i kernen har vi

, hvor aon og aoff er henholdsvis bindings- og afbindingsfunktionerne (se S2 i de supplerende oplysninger for nærmere oplysninger). aon er en funktion af na, mens aoff er uafhængig af na. Ligning (2) viser, at når m stiger, konvergerer til en deterministisk værdi, som er en monotont stigende funktion af na (Fig. 1c-d og Fig. S1; dette er en generel egenskab og kan anvendes på tilfælde, hvor antallet af kognate bindingssteder på enhancer er større end én (se ligninger S13-S18))). Denne konvergens indebærer, at selv den tidsvarierende koncentration af aktivatorer kan indkodes af RTOR, forudsat at aktivatorerne cykler på og fra enhancer tilstrækkeligt hyppigt over et tidsvindue med en næsten uændret koncentration af dem. Der findes faktisk aktive dissocieringsmekanismer, som garanterer en hurtig cyklus af aktivatorer9,19,20,21,22. Bindingstiden blev anslået til at ligge i intervallet fra sekunder til titusindvis af sekunder9,10. Det blev desuden påvist på det endogene CUP1-gen, at en sådan hurtig cyklus er funktionel10. Formentlig koder RTOR for koncentrationen af transkriptionelle aktivatorer. På den anden side er sandsynligheden for, at enhanceren findes bundet af en sådan aktivator i det tidsrum, hvor aktivatorerne cykler til og fra enhanceren m gange, . Da gennemsnittet af over ensemblet også er f(na), har vi

De begrænsende betingelser, der sikrer pålidelige transkriptionelle responser

Givet stokasticiteten i forekomsten af transkriptionelle hændelser kræver det for at opnå et pålideligt transkriptionelt respons, at RTOR-koden, som rettidigt repræsenterer koncentrationen af aktivatorer, skal omsættes med høj fidelitet til mængden af transkriptioner. Hvis P(S), og ideelt set alle var lig med 1, ville den nøjagtige informationstransduktion være opnået. I det følgende præsenterer vi de betingelser, hvorunder disse tre faktorer kan være store nok til at sikre pålidelige transkriptionelle reaktioner i nærvær af tilfældige fluktuationer (figur S2 og S3 giver intuitive forklaringer på denne underafdeling).

Sammenligning (3) indebærer, at koncentrationen af aktivatorer ikke kan være tilstrækkeligt kodet uden SCF’s persistens på promotoren. SCF’en bør således samles hurtigt, når kromatinarkitekturen tillader det, og være meget mere stabil end de enhancerbundne aktivatorer (betingelse I). En sådan stabilitet af SCF blev observeret eksperimentelt, og bindingstiden for TBP (TATA-bindingsprotein, SCF’s kernekomponent) på promotoren kan være op til 20 minutter i humane celler11. For er Aj en forudsætning for forekomsten af J. Da RTOR bestemmes af de enkelte korte bindingstider for aktivatorer, bør J ske umiddelbart efter forekomsten af Aj (fig. S3). Ellers går informationen om RTOR stort set tabt eller udnyttes endog fejlagtigt til at lede transkriptionsinitiering (bemærk, at J er en forudsætning for M). For at overføre RTOR-koden korrekt bør Mediator derfor handle ved at vente på at binde de cyklende aktivatorer og overføre informationen gennem allosteri23,24,25 (betingelse II). Dette skyldes, at andre former for molekylære interaktioner som f.eks. frie kollisioner ikke præcist kan overføre oplysninger om bindingstidspunktet for aktivatorer. En sådan allosterisme hos Mediator understøttes af tidligere arbejde26. bestemmer, hvordan de oplysninger om RTOR, der er nedarvet af J, omdannes til at styre mængden af transskriptioner. Da RTOR afhænger af den intermitterende binding af aktivatorer, kræver en stor , at der i de korte bindingsperioder skal produceres transkripter med en ret hurtig hastighed (fig. S2) (betingelse III). Dette træk er også verificeret ved beregningsmæssige skøn over de eksperimentelle data (se S3 i Supplerende oplysninger). Derfor kan alle tre betingelser opfyldes naturligt.

Den dynamiske mekanisme for aktivatorreguleret transkription

De ovennævnte tre begrænsningsbetingelser bestemmer tilsammen, hvordan TA’en fungerer. Der opstår gentagne gange en tilstand, hvor der dannes et relativt stabilt klemmelignende rum mellem mediatoren og forstærkeren (fig. 2; i henhold til betingelser I og II). Da det eksperimentelt blev vist, at SCF ikke er særlig stabil11 , opbygges dette rum midlertidigt. Det klemme-lignende rum tiltrækker frie aktivatorer og skræller dem derefter hurtigt af, idet RTOR bestemmes af aktivatorernes koncentration (i henhold til ligninger (2-3)). Når et aktivatormolekyle kommer ind i dette rum, opstår der allosteri i Mediator, hvilket resulterer i en lettere omstændighed for GTF’erne og andre beslægtede proteiner til at udføre deres funktioner. Som følge heraf kan Pol II’erne indlede/genindlede transkriptionen meget hurtigt (i henhold til tilstand II og III), idet RTOR styrer mængden af transkriptioner.

Illustration af den dynamiske mekanisme for TA, der orkestrerer et pålideligt transkriptionelt respons.

Der opstår gentagne gange en tilstand, hvor der dannes et relativt stabilt klemmelignende rum mellem Mediator og enhancer. Transkriptionsaktivatorer cykler hurtigt ind og ud af dette rum. Kun når dette rum er besat af aktivatorer, initierer/geninitierer Pol II’erne transkription med en hurtigere hastighed end aktivatorernes cyklushastighed.

Denne mekanisme tyder på, at de molekylære interaktioner, der involverer promotoren, adlyder elegante dynamiske principper som følger. Mens det klemmelignende rum dannes midlertidigt, er det meget mere stabilt end de aktivatorer, der sætter sig i det. Aktivatorerne kan cykle ind og ud af rummet mange gange selv i korte episoder, hvor deres koncentration næsten forbliver uændret; således kan koncentrationen af aktivatorer repræsenteres af RTOR rettidigt. Da Mediator overfører informationen via allosteri, og da transkriptionens genstartshastighed er meget større end aktivatorernes cyklushastighed, anvendes RTOR-koden effektivt til at styre mRNA-syntesen. Med et ord er det klemmeagtige rum det strukturelle grundlag for pålidelige transkriptionelle reaktioner. I stedet for at være en hindring udnyttes den stokastiske karakter af de molekylære interaktioner fuldt ud til at inducere transkriptionen pålideligt; dette afhænger i høj grad af forskellige grader af stabilitet af komponenterne i TA’en, som spænder over flere størrelsesordener. Ovenstående argumenter understøttes af eksperimentelle data, og de typiske tidsskalaer er som følger: den halve levetid for det klemmelignende rum er ca. 5 min11 , aktivatorernes belægningstid i rummet ligger inden for intervallet sekunder til titusindvis af sekunder10 , allosteri sker normalt inden for en tid på millisekunder til højst 1 sekund23,24,25 , og det tager blot flere sekunder at genstarte en transkription (se S3 i Supplerende oplysninger).

Validering af mekanismen ved hjælp af numeriske simuleringer

For yderligere at verificere den foreslåede dynamiske mekanisme opbygger vi en forenklet stokastisk model af gentranskription med fysiologisk realistiske parametre (se fig. S4 og S4 i Supplerende oplysninger for detaljer). Denne model skildrer de vigtigste tilstandsovergange i TA og beskriver også simpelthen den relaterede kromatindynamik, hvorved den er i stand til at karakterisere transkriptionens respons på transkriptionelle aktivatorer. I det følgende betegner “input” og “output” henholdsvis den nukleare koncentration af aktivatorer og mængden af genprodukter, mRNA eller protein.

Først undersøger vi den tidsmæssige udvikling af antallet af cellulære mRNA’er ved konstante inputniveauer (fig. 3a). Navnlig produceres mRNA’er på en burst-lignende måde, hvilket er i overensstemmelse med den fremherskende opfattelse14,27,28,29,29,30,31,32. For input på lavt niveau transskriberes den ene allel, mens den anden er tavs i en diploid celle, og dermed er bursting-fænomenet tydeligt. For input på højt niveau bryder begge de to alleler imidlertid ofte ud, således at summen bliver næsten konstant. Dette tyder på, at fænotypen med vedvarende forhøjede transkriptionelle reaktioner kan observeres ved høje inputniveauer14.

Transkriptionelle reaktioner på aktivatorer baseret på den foreslåede dynamiske mekanisme.

Inputtet er lig med aon/aoff, som er positivt relateret til den nukleære koncentration af aktivatorer. (a) Tidsmæssig udvikling af antallet af cellulære mRNA’er i en enkelt diploid celle med forskellige inputniveauer. mRNA’er, der produceres af to alleler, er vist separat i rødt og sort. Transkriptionsudbruddet bliver tættere med stigende inputstyrke. (b) Det gennemsnitlige input/output-forhold i individuelle diploide celler. De maksimale outputs er normaliseret til 1. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelsen af output, SDout. Indsætningen viser forholdet mellem SDout og det gennemsnitlige output i forhold til input. Da mRNA’ernes eller proteinernes hyppighed også afhænger af deres nedbrydnings-/inaktiveringshastighed, som moduleres af cellulær signalering, afspejler mRNA-produktionens hastighed mere direkte dynamikken i TA (se også Fig. S9, hvor produktionshastigheden for proteiner også er vist44,45). (c) Kurverne for SDout vs. input. Disse kurver forbliver næsten klokkeformede, selv ved forskellige nedbrydningshastigheder for mRNA’er eller proteiner (se også Fig. S10). (d) Fordelingen af mRNA-niveauer på tværs af en cellepopulation for forskellige inputniveauer. Bin-størrelsen er 10. (e) Tilstandsudviklingen af en promotor som reaktion på et periodisk varierende input. G1 angiver, at forstærkeren er bundet af en aktivator. SCF angiver, at kernepromotoren er bundet af SCF. OPC angiver, at kernepromotoren befinder sig i OPC-tilstand. Kurverne beskriver henholdsvis input, de tilsvarende tilstande for promotoren og produktionen af mRNA’er (fra top til bund). (f) ChIP-simulering af det transkriptionelle respons. Input og symbolerne er de samme som i panel (e). TATAn og Pol II angiver, at kernepromotoren er bundet af henholdsvis histoner og Pol II.

En nyere eksperimentel analyse udelukkede muligheden for, at kromatinmiljøet spiller en central rolle i udformningen af transkriptionel udbrud32. Her viser vi, at en burst af transkriptioner stammer fra vedvarende reinitiering af Pol II’er, når det klemmeagtige rum er besat af aktivatorerne (Fig. 4). Det vil sige, at initieringen af mRNA i sig selv er burst-lignende. Udbruddet er ikke blot støj; det er i stedet en direkte manifestation af RTOR-koden, som repræsenterer koncentrationen af aktivatorer og styrer mRNA-produktionen.

Kernen i et transkriptionelt udbrud.

Det viste er en mikroskopisk visning af et transkriptionelt udbrud. ‘CA’ angiver, at en aktivator befinder sig i det klemmelignende rum. ‘OPC’ angiver, at transkriptionsmaskineriet befinder sig i OPC-tilstanden (der vises også et panel, hvor der kan zoomes ind). Når et aktivatormolekyle er til stede i det klemmeagtige rum, resulterer hurtig transkriptionel reinitiering i et burst af mRNA’er.

For det andet undersøger vi det gennemsnitlige input/output-forhold i transkriptionel respons. Det gennemsnitlige output ligner en Hill-funktion af input, som er almindeligt anvendt i systembiologi til at modellere genekspression3,33,34 (fig. 3b). Kurven for standardafvigelsen SDout for output i forhold til input er omtrent klokkeformet (fig. 3c). Intensiteten af den intrinsiske støj, der er defineret som forholdet mellem SDout og det gennemsnitlige output35 , er omvendt korreleret med input (indsat i fig. 3b). Desuden er ovenstående træk ufølsomme over for de små udsving i input (dvs. extrinsisk støj) (Fig. S5), hvilket tyder på robustheden af transkriptionens reaktion på støj. Alle disse resultater er i god overensstemmelse med de eksperimentelle målinger i både Saccharomyces cerevisiae36 og Drosophila-embryoner37. Især er den venstre side af SDout-kurven lavere end dens højre side; dette træk er næsten kvantitativt i overensstemmelse med de eksperimentelle data37 (se S5 i de supplerende oplysninger for yderligere diskussioner). Derimod ville afvigelser fra de dynamiske principper, der er foreslået ovenfor (herunder de omstændigheder, hvor aktivatorernes cyklus er langsom, stilladskomplekset/klampelignende rum ikke er stabilt, eller/og hastigheden af transkriptionel reinitiering er lav), reducere TA’s evne til at reagere pålideligt på input (Fig. S6).

Det input/output-forhold, der blev observeret i Drosophila-embryoner, blev antaget at blive realiseret ved maksimalt at udnytte grænsen for molekylære interaktioner37,38,39. Egenskaberne ved sådanne mikroskopiske interaktioner er integreret for at blive makroskopisk manifesteret som SDout. SDout-kurven er stadig klokkeformet overordnet set sammenlignet med SDin-kurven (jf. fig. 1d). Det vil sige, at RTOR-kodens signatur kan overføres direkte til udgangen. Dette bekræfter, at den tidsmæssige belægningsgrad af aktivatorer virkelig udnyttes til at regulere transkriptionen, og at Mediator overfører informationen gennem allosteri. På den anden side er SDout-kurven asymmetrisk, idet den højre side er højere end den venstre side. Årsagen er indlysende. Når input er meget højt, er forstærkeren bundet af aktivatorerne næsten hele tiden, og fluktuationerne afspejler således hovedsagelig SCF’s dynamiske egenskaber og Pol II’s transkriptionelle geninitiering. Vores yderligere simuleringer viser, at den højre side af SDout-kurven falder, når stabiliteten af SCF’en eller hastigheden af transkriptionel reinitiering øges; kun når deres styrke øges ud over de fysiologiske områder, kan kurven blive symmetrisk (Fig. S6F). Dette bekræfter også, at både P(S) og faktisk er store nok. Derfor bør SDout’s egenskaber endegyldigt bevise den mikroskopiske transkriptionelle mekanisme.

For det tredje undersøger vi fordelingen af mRNA-niveauer på tværs af en stor cellepopulation udsat for det samme input (Fig. 3d). For små input er bursting-fænomenet særlig tydeligt, og de fleste celler har ingen eller få mRNA’er. Dette er i overensstemmelse med den eksperimentelle observation27,30,31. Men fordelingen bliver gradvist normal, efterhånden som input øges. For aon/aoff >1 bliver fordelingen skarpere med stigende input. Disse resultater afventer eksperimentel identifikation.

For det fjerde simulerer vi den transkriptionelle respons på et periodisk varierende input. Den mikroskopiske proces på en promotor er ret dynamisk og stokastisk, og de forskellige komponenter i TA udviser forskellige stabiliteter (Fig. 3e). Mængden af mRNA’er kan dog følge input. Disse resultater er i god overensstemmelse med de resultater, der er afsløret ved FRAP, dvs. at TA’en er et meget dynamisk apparat8,10,11,22. På den anden side afslører simuleringer af chromatin-immunoprecipitationsassays (ChIP), som karakteriserer den tidsmæssige udvikling af fordelingen af forskellige tilstande af promotoren blandt en cellepopulation, en stærk regelmæssighed i fordelingerne (fig. 3f). Mønstrene for både aktivatorer, der binder sig til enhancer, og SCF og Pol II, der binder sig til promotoren, følger input. mRNA-transskriptioner produceres i fase med input, mens histoner besætter promotoren i en omvendt fase. Alle disse resultater er i god overensstemmelse med de eksperimentelle resultater22,40. Derfor kan de observerede uoverensstemmelser mellem resultaterne fra FRAP- og ChIP-eksperimenterne skyldes de forskellige opløsninger, der er involveret i målingerne. ChIP-målinger integrerer molekylære interaktioner både tidsmæssigt og i hele cellepopulationen, mens FRAP i højere grad afspejler de øjeblikkelige interaktioner. Desuden er det transkriptionelle respons på det tidsvarierende input robust over for extrinsisk støj, men følsomt over for sammensatte input-signaler, og afvigelser fra de dynamiske principper (som f.eks. tilfælde med lav cyklingshastighed for aktivatorer, det ustabile stilladskompleks/klampelignende rum eller/og lav transkriptionel reinitieringshastighed) vil reducere responskapaciteten (se figur S7 og S8).