Cellekulturreagenser

En glyceroloplagring af Human Akt1 ORF blev opnået som pENTR221-vektor fra GE Dharmacon (Human Akt1 ORF Clone ID 100067600). Modificeret destinationsvektor (pcDNA/FRT/TO), der indeholder SH Tag, var en generøs gave fra Dr. Matthias Gstaiger (Institut for Molekylær Systembiologi, ETH Zürich, Zürich, Schweiz). Flp-In TREx HEK293-celler (#R780-07), LR Clonase II-enzymblanding (#11791-100), pOG44-vektor (#V6005-20), Zeocin (#46-0509), Blasticidin S (#R210-01), Hygromycin B (#10687-010), Tet (#550205) og Dynabeads Protein A (#100.02D) blev fremstillet hos Invitrogen. Xtremegene 9 (#06365787001) blev erhvervet fra Roche. DMEM (#12430-054) og RPMI 1640 (#22400-089) blev fremstillet af GIBCO. Trypsin (#CC5027.010L) blev købt hos Genetics. Normal FBS (#SH30070.03) samt Tet-screenet FBS (#SH30070.03T) blev indkøbt fra Hyclone. Aphidicolin (#A0781-10MG), Nocodazol (#M1404-10MG), Propidiumjodid (#P4170-250 mg) og Lys C-protease (#P3428) blev fremstillet af Sigma. SILAC-mærkater blev anskaffet fra Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Proteaseinhibitorcocktail (100X) (#78429) og Pierce anti-HA agaroseperler (#26182) blev fremstillet af Thermo Scientific. MagStrep ‘Type 2HC’-perler (#2-1612-002) blev anskaffet fra IBA BioTagnology. Bioconcept Labs Pvt Ltd, Gurgaon, Indien, syntetiserede HA-peptidet . Nitrocellulosemembran (#RPN303E) blev købt fra GE Healthcare. Trypsinprotease (#4370282) blev indkøbt fra AB Sciex. Full range rainbow protein molekylvægtmarkør (#RPN800E) kom fra Amersham. siRNA’er, Dharmafect Transfection Reagent (#T-2001-03), RNase Free Water (#B-003000-WB-100), 5X siRNA buffer (#B-002000-UB-100) blev købt hos Dharmacon. RNase A (#19101) kom fra Qiagen.

Antistoffer til Western Blot

Antistoffer, der blev anvendt i denne undersøgelse, var: anti-HA (#SC-7392; musemonoklonalt, fortynding 1:3000); anti-AKT1 (#SC-5298; musemonoklonalt, fortynding 1:3000); anti-AKT1 (#SC-5298; musemonoklonalt, fortynding 1:1000) og anti-GAPDH (#SC-25778; kaninpolyklonalt, fortynding 1:1000) fra Santa Cruz; anti-CDC2 (#77055; kaninpolyklonalt, fortynding 1:1000); anti-CCNB1 (#4138; kaninpolyklonalt, fortynding 1:1000); anti-CCNB1 (#SC-25778; kaninpolyklonalt, fortynding 1:1000) fra Santa Cruz:1000) fra Cell Signalling Technology; anti-BUB3 (#ab133699; kaninmonoklonalt, fortynding 1:10000); anti-API5 (#ab56392; musemonoklonalt, fortynding 1:1000) og anti-SH3PX1 (#EPR14399; kaninmonoklonalt, fortynding 1:1000) fra Cell Signalling Technology; anti-BUB3 (#EPR14399; kaninmonoklonalt, fortynding 1:2000) fra Abcam; sekundære antistoffer blev anskaffet fra Licor Biosciences-Odyssey gede-anti-mus (#926-32210, fortynding 1:15000) og Odyssey gede-anti-kanin (#926-32211, fortynding 1:15000).

Generering af stabil cellelinje

I denne undersøgelse blev gateway-kompatibel Akt1-indgangsvektor (pENTR221) anvendt til at generere et ekspressionskonstrukt ved LR-rekombinationsreaktion i nærværelse af en egnet destinationsvektor (pcDNA/FRT/TO). Destinationsvektoren blev modificeret til at omfatte et Strep-HA (SH)-tag indeholdende et streptavidinbindende peptid (Strep) og et hæmagglutininin (HA)-epitoptag. Dette SH-tag blev i sidste ende brugt til selektivt at trække Akt1 og dets interagerende partnere ud af komplekse cellelysater selektivt. For at generere en inducerbar Akt1-ekspressionscellelinje blev ekspressionskonstruktionen co-transficeret med pOG44-rekombinase i Flp-In TREx HEK293-celler, der stabilt udtrykker Tet-repressoren. Transfektion blev lettet ved hjælp af Xtremegene 9 transfektionsreagens. Celler, der udtrykker Akt1-konstruktet, blev udvalgt over en periode på 15-20 dage i hygromycin-B (75 µg/ml) indeholdende RPMI-medium, suppleret med 10 % Tet-screenet FBS. Disse udvalgte celler blev senere samlet for at ekspandere til pulldown-eksperimenter.

Tet-koncentrationen, der kræves for optimal Akt1-ekspression, blev bestemt ved at inducere Akt1-ekspression over et interval af Tet-koncentrationer (0,1 µg/ml til 5 µg/ml), og proteinekspressionsniveauerne af Akt1 blev overvåget i tilstedeværelse og fravær af Tet ved hjælp af anti-Akt1- samt anti-HA-antistof. Tet blev suppleret til kulturmedierne hver 24. time for at opretholde en stabil Akt-ekspression.

PDT Eksperiment

PDT for HEK293-celler blev overvåget i normale versus Akt1-overeksprimerende celler over en varighed på 72 timer efter den første indgivelse af Tet. For hvert observationstidspunkt blev et parallelt sæt på 104 normale og Akt1-overudtrykkende HEK293-celler udsået i triplikater i en 96 brøndplade i 100 µl DMEM-medie indeholdende 10 % serum. Der blev tilsat Tet til kulturmediet 24 timer efter udsåning, og efter endnu et inkubationsinterval på 24 timer blev cellerne høstet som tidspunkt 0. Herefter blev et sæt celler i parallelkultur høstet hver 24. time op til 72 timer. PDT blev bestemt ved at tælle cellerne på hvert tidspunkt ved hjælp af trypanblå farvningsmetoden.

SILAC-mærkning til differentiering af det cellecyklusfasespecifikke Akt1-interaktom

Akt1-overeksprimerende HEK293-celler blev ekspanderet og dyrket i SILAC-medier indeholdende “lette” (K0R0), “medium” (K6R6) eller “tunge” (K8R10) isotoper af lysin (K) og arginin (R) i mindst 5 celledoblinger for at muliggøre fuldstændig inkorporering af mærket. Ved 70 % konfluens blev Tet (1 µg/ml) tilsat mediet for at inducere Akt1-ekspression. K0R0-mærkede celler blev arresteret i G0-fasen ved serumsult natten over, hvilket er en almindeligt anvendt metode til at arrestere celler i G0-fasen42. Hertil blev normale komplette kulturmedier erstattet med RPMI uden serum, og cellerne blev holdt i kultur i 16-18 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. K8R10-mærkede celler blev standset i G1/S-fasen ved at dyrke cellerne natten over i tilstedeværelse af 5 µg/ml aphidicolin; en reversibel inhibitor af eukaryotisk nukleær DNA-replikation43. Tilsvarende blev der med henblik på G2-arrest tilsat 400 ng/ml nocodazol til kulturmediet for K6R6-mærkede celler, og inkubationen blev fortsat i 16-18 timer, inden cellerne blev pelleteret. Nocodazol griber ind i polymeriseringen af mikrotubuli og arresterer derved cellerne i G2/M-fasen44. De arresterede celler blev trypsiniseret og optalt separat ved hjælp af trypanblå farvningsmetoden. Celler, der er arresteret i forskellige faser af cellecyklus, blev derefter pelleteret ved centrifugering ved 1500 rpm i 10 minutter. Der blev fremstillet flere cellepellets for hver cellecyklusfase og opbevaret ved -80 °C, indtil de blev anvendt.

SH-tagged Affinitetsoprensning

Samme antal Akt1-overudtrykkende celler, der var arresteret i G0-, G1/S- og G2-faser, blev blandet i forholdet 1:1:1 og lyseret på is i 1 time i IP-buffer (150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH7,5; 1 % NP-40; 1X proteaseinhibitorcocktail og 1 mM PMSF). Celle lysat blev renset for debris efter centrifugal separation ved 10 000 rpm i 15 minutter ved 4 °C. Akt1-proteinkomplekser blev selektivt oprenset i parallelle sæt ved at målrette Strep- og HA-tag samtidigt, som angivet i manualerne for de respektive kits. Kort fortalt blev strep-taggede Akt1-proteinkomplekser blandet med 100 µl streptactin-magnetiske perler og holdt i 1 times inkubation på en roterende shaker ved 4 °C. Eventuelle uspecifikke interaktorer blev vasket væk i fem på hinanden følgende vasketrin med fem perlevolumener af streptactinvaskebuffer. Akt1-protein og dets interaktorer blev til sidst elueret i to elueringstrin med 125 µl strep elueringsbuffer pr. eluering (Invitrogen). Til oprensning af HA-mærkede Akt1-proteinkomplekser blev rensede cellelysater inkuberet med 50 µl forvaskede HA-agaroseperler i 2 timer ved 4 °C på en roterende omryster i 2 timer. Efter tre hurtige vaskninger med ti perle-volumener TBS-T-buffer blev Akt1-proteinkomplekser elueret tre gange med 50 µl HA-peptid (250 µg/ml). Ovenstående oprensningstrin blev udført for tre sådanne biologiske replikater for at oprense Akt1-protein og dets interagerende partnere, og Strep- og HA-eluaterne for hver replikat blev samlet, lyofiliseret og opbevaret ved -80 °C indtil videre behandling.

Proteinfordøjning og prøveforberedelse til LC-MS/MS

Alle tre biologiske replikater blev behandlet til proteinfordøjning separat. Til den lyofiliserede prøve blev der tilsat 40 µl 100 mM ammoniumbicarbonat, hvorefter der blev vortexet godt og derefter tilsat 2 µl denatureringsbuffer (AB Sciex). Prøverne blev reduceret med 4 µl reduktionsreagens (AB Sciex) i 1 time ved 60 °C. Der blev tilsat 2 µl cysteinblokeringsreagens i 10 minutter ved stuetemperatur for at blokere reducerede cysteinrester. Proteinfordøjelsen blev indledt ved at tilsætte 5 µl 0,1 µg/µl endo-proteinase Lys C. Prøverne blev inkuberet i 4 timer i et vandbad ved 37 °C. Efter en kort centrifugering blev der tilsat 1 µl trypsin (1 µg/µl) til prøverne, hvorefter inkubationen fortsatte i yderligere 12-16 timer ved 37 °C. Proteinfordøjelsen blev afsluttet ved at tilsætte en dråbe myresyre (FA).

Syrnede prøver blev lyofiliseret og underkastet peptidrensning ved hjælp af monospin C-18-kolonner. Før brug blev C-18-kolonnerne konditioneret med methanol og vand og yderligere equilibreret med 3 % ACN i 0,1 % FA. De frysetørrede prøver blev opløst i 3 % ACN i 0,1 % FA og lagt på C-18-kolonnerne og fik lov til at binde i 10 minutter. Prøverne blev passeret to gange gennem kolonnerne for at sikre fuldstændig binding. Efter 10 stringente vaskninger med 3 % ACN i 0,1 % FA blev de fordøjede peptider først elueret i 40 % ACN efterfulgt af to elutioner i 60 % ACN. Endelig blev de tre eluater samlet og frysetørret for hver gentagelse.

De eluerede peptider blev opløst igen i 500 µl 5 mM ammoniumformiat (pH 2,5) i 30 % ACN og forsigtigt hvirvlet. Kationbytterpatronen blev fikseret og konditioneret, inden prøven blev indlæst. Efter påfyldning af prøven blev patronen vasket tre gange med 5 mM ammoniumformiat (1 ml). Peptiderne blev genelueret to gange med 400 µl 500 mM ammoniumformiat (pH 2,5) i 30 % ACN pr. eluering, og eluaterne blev samlet for hver prøveudskrift og frysetørret.

Massespektrometri Eksperimentelt design og statistisk rationale

LC-MS/MS-analyse

Alle prøver blev analyseret ved nano-flow-væskekromatografi på et nanoflex-system (Eksigent Technologies, AB Sciex) koblet til et tredobbelt TOF 5600-massespektrometer (AB Sciex; Concord, Canada). Hver biologisk replikat blev injiceret to gange som tekniske replikater. Systemet blev drevet ved hjælp af en binær fasegradient med opløsningsmiddel A (2 % ACN i 0,1 % FA) og opløsningsmiddel B (98 % ACN i 0,1 % FA). For at opnå optimal reproducerbarhed af prøveafgivelsen blev autosampleren anvendt i fuld injektionstilstand og overfyldte 1 µl-loop’en med 3 µl prøve. Til målingerne af hver prøveinjektion blev peptiderne fanget på cHiPLC-trap, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 0,5 mm × 200 µm (Eksigent) og separeret på en cHiPLC-kolonne, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 15 cm × 75 µm (Eksigent) ved 300 nl/minutters strømningshastighed ved hjælp af lineær gradient: 5-60 % opløsningsmiddel B i 80 minutter, 60-90 % i 2 minutter. Kolonnen blev regenereret ved vask med 90% opløsningsmiddel B i 6 minutter og re-equilibreret med 5% opløsningsmiddel B i 22 minutter.

Massespektrometeret var koblet til en Nano Spray Ion Source (AB Sciex), styret af Analyst-software (v.1.6). Ionkilden var udstyret med en 10 μm SilicaTip elektrospray PicoTip-emitter (AB Sciex), og de eluerede peptider blev overvåget ved hjælp af følgende ionkildeparametre: IHT = 130°, ISVF = 2100 v, GS1 = 20, gardingas = 25. Massespektrometeret blev drevet i informationsafhængig erhvervelse (IDA) top10-tilstand og højfølsomhedstilstand med 500 og 200 ms akkumulationstid for henholdsvis MS1- og MS2-scanninger og 12 s dynamisk udelukkelse, hvilket resulterede i en samlet duty cycle på ~2,55 s. Massespektrometeranalysen blev udført ved hjælp af TOF-MS1- og MS2-undersøgelsesscanninger i intervallet 350-1250 og 140-1600 m/z. Den rullende kollisionsenergi blev automatisk styret af IDA’s rullende kollisionsenergiparameterscript. Udvælgelseskriterierne for den moderion, der skal fragmenteres, omfattede intensitet – hvor ionerne skulle være større end 150 cps, massetolerance på 50 mDa og med en ladningstilstand på +2 til +5. Der blev foretaget en automatisk kalibrering af spektrer efter erhvervelse af hver 2 prøver ved hjælp af dynamisk LC-MS og MS/MS-erhvervelser af 25fmol β-galactosidase.

Databehandling og analyse

MS-MS erhvervelse af Akt1 og dets interagerende proteinpartnere blev formidlet i 3 forskellige cellecyklusfaser, dvs. G0, G1/S og G2-fase. SILAC-mærkede celler, der repræsenterer hver fase, blev samlet i tre separate sæt og undersøgt som biologiske replikater. Indsamling af hver biologisk replikat resulterede i 2 wiff- og 2 wiff.scan-filer, der repræsenterer de tekniske replikater. Wiff-filerne blev igen samlet for hver biologisk replikat, inden der blev søgt i UniProtKB/SwissProt Human-databasen (udgivelse april 2015) ved hjælp af proteinpilotsoftware, version 4.5 (revision nr. 1656). Referencedatabasen bestod af 20 204 proteinposter i den angivne udgave. Proteinpilot-søgningen var baseret på paragon-algoritmen, en del af standardstatistikken i softwaren. Følgende indstillinger blev anvendt til paragon-søgninger – (a) art som Homo sapiens, (b) Lys C og Trypsin som enzymkategorier for forskellige kørsler, (c) maksimale oversåede spaltninger = 2, (d) faste modifikationer som SILAC-mærkater – K6R6 og K8R10; cysteinalkylering ved hjælp af methylmethanethiosulfonat (MMTS), (e) variable modifikationer som oxidation ved methionin, som er en standardindstilling i proteinpilot, (f) identifikation, SILAC (Lys + 6, Arg + 6) og SILAC (Lys + 8, Arg + 10) som prøvetyper, og (g) parameteren “Search Effort” “Thorough ID”, som giver os en bred søgning af forskellige proteinmodifikationer, (h) massetolerancen for forløber- og fragmentioner var 0.05 og 0,1 Da, henholdsvis. For hver biologisk replikat pr. SILAC-mærke blev der genereret Lys C- og Trypsin-digiterede filer. Følgende parametre blev anvendt til at filtrere dataene for at opnå et sikkert datasæt til efterfølgende analyse – a) Der blev anvendt en automatisk bias-korrektionsalgoritme for forholdet mellem tunge og lette data. Den korrigerer for ulige blanding under kombinationen af de forskellige mærkede prøver i et eksperiment og fjerner enhver eksperimentel eller systematisk bias. Den automatiske bias-faktor øger nøjagtigheden af kvantificeringen ved at normalisere variationer i de oprindelige proteinmængder45, (b) Proteiner med en global falsk opdagelsesrate (FDR) på 1% fra fit (G-FDR-fit) blev bibeholdt. FDR-analysen blev udført ved hjælp af Proteomics Performance Evaluation Pipeline Software (PSPEP), der er installeret sammen med proteinpilotsoftware; (c) Mindste grænseværdi for proteinkonfidens blev sat til 95 %; (d) Identifikation af mindst ét unikt peptid med 95 % konfidens på tværs af alle tre replikater.

Lister over proteiner erhvervet efter Lys C- og Trypsinfordøjelse blev puljet pr. biologisk replikat. Kvantificeringsforhold mellem mellemstore og tunge SILAC-mærkede proteiner i forhold til deres lysere modstykker blev gennemsnitliggjort. Efterfølgende fik vi tre proteindelister pr. SILAC-mærkning – K0R0, K6R6 og K8R10. Herefter blev der udarbejdet en foreningsliste over de identificerede proteiner; kvantitativ vurdering blev kurateret manuelt ved at sammenlægge filer fra tre biologiske replikater for hver SILAC-betingelse. Proteiner, der blev identificeret i alle tre replikatsæt, blev bibeholdt til efterfølgende analyse, og de kvantitative forhold mellem medium og tunge mærker i forhold til lette mærker for disse proteiner blev gennemsnitligt opgjort. Der blev derefter udarbejdet en endelig kombineret fil for K0R0 (G0-fasen), K6R6 (G2-fasen) og K8R10 (G1/S-fasen). Et protein kvalificerede sig kun til at være på den endelige Akt1-interaktorliste, hvis det blev identificeret i alle 3 replikatsæt for nogen af cellecyklusfaserne. Proteiner, der blev identificeret, men ikke kvantificeret i alle tre replikater, fik tildelt en kvantificeringsværdi på 0,01 (minimum) eller 100 (maksimum) efter at være trængt ind i peptid-SILAC-forholdet.

For at beskære listen over Akt1-interaktører yderligere for eventuelle uspecifikke interaktioner med affinitetsmatricen eller tagget i sig selv blev SH-tagget GFP overudtrykt i HEK293-celler. GFP-proteinets interaktionspartnere blev selektivt elueret som beskrevet for Akt1-proteinkomplekser. Proteiner, der overlappede med Akt1-cellecyklusfasespecifikke interactome, blev fjernet fra Akt1-interactors-listen som uspecifikke proteiner. Dette gav os endelig et sikkert datasæt for vekselvirkningspartnere for Akt1. En oversigt over oplysninger om de Akt1-interagerende proteiner og deres kvantificeringsestimater findes i den supplerende tabel 3. Ved at dividere dem med Akt1-forholdet i respektive fase normaliserede kvantitative forhold for alle Akt1-interaktorer. Dette gav ensartethed for Akt1 som 1 i G0-, G1/S- og G2-faserne.

Polyacrylamidgelelektroforese og Western blotting

Fra listen over identificerede Akt1-interaktorer blev CDK1, CCNB1, BUB3, API5 og SH3PX1 tilfældigt udvalgt til at validere deres association med Akt1 ved western blotting. Asynkroniseret Akt1-eksprimerende cellepellet blev lyseret i IP-buffer og underkastet affinitetsrensning med målretning mod SH-tag som beskrevet tidligere. Eluater blev samlet og fortyndet i 1X SDS prøvebuffer og opvarmet i 10 minutter og opløst på 10 % SDS-PAGE. Proteinbåndene blev overført til nitrocellulosemembran, og sidstnævnte blev blokeret med 1:1 odyssey-blokeringspuder: PBS i en time ved stuetemperatur. Derefter blev membranen skåret op for at gøre det muligt at undersøge proteiner af forskellig størrelse med de respektive primære antistoffer til validering sammen med anti-HA-antistof. Fortyndingen af det primære antistof blev foretaget i odyssey-buffer: PBST og blev inkuberet natten over ved 4 °C på en shaker. Efter grundig vask blev blottene eksponeret for de respektive IR-mærkede sekundære anti-mus- eller anti-kanin-antistoffer i en fortynding på 1:15000; fortyndet i odyssey-buffer: PBST. Båndene blev detekteret ved hjælp af odyssey infrarød scanner.

Reverse co-immunopræcipitation blev også udført ved hjælp af Dynabeads protein A. De tidligere påviste Akt1-interaktorer blev anvendt som lokkemadproteiner, og Akt1 blev undersøgt som deres interagerende partner ved hjælp af anti-Akt1-antistof. Antistoffer mod de udvalgte Akt1-interaktorer blev blandet med 50 µl dynabeads i separate rør i en koncentration på 1:20-1:70; de blev fortyndet i 200 µl PBST. Blandingerne af perle-antistof blev opbevaret til inkubation ved stuetemperatur i 10 minutter. Perle-antistofkomplekser blev pelleteret ved hjælp af en magnetisk separator og re-suspenderet i 200 µl PBST med henblik på vask. Derefter blev der tilsat 250 µl lysat til hvert rør, hvorefter det blev inkuberet ved 4 °C i 2 timer på en roterende shaker. Perlerne sammen med de respektive antistof-antigenkomplekser blev igen pelleteret og vasket tre gange med 200 µl PBST pr. vask. Derefter blev perlerne kogt i 50 µl 1X SDS prøvebuffer i 10 minutter og derefter afkølet. Supernatanten blev indlæst på 10 % SDS-PAGE og undersøgt ved western blotting. Anti-Akt1-antistof blev anvendt til at undersøge for Akt1 i udskillelse af API5, CCNB1, CDK1, BUB3 og SH3PX1.

GO-klassifikation

GO-klasser, der skildrer funktionen af hver Akt1-interaktør, blev bestemt fra UniProt (http://www.uniprot.org/) og EnrichR-databaser (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/). Efter omfattende manuel kuratering blev de identificerede Akt1-interaktorer opdelt i 3 store funktionelle klasser, dvs. proliferation og overlevelse, metabolisme og proteinsyntese. Resten blev afbildet som en fælles klasse kaldet “andre”, som omfattede proteiner med funktioner som transport, hæmatopoesi osv.

Gen Knockdown ved hjælp af siRNA

Standardisering

For at bestemme den optimale koncentration af siRNA til transfektion blev 1,2 × 105 HEK293-celler udsået i en 12-well-plade. siRNA mod PLK1 blev brugt som en positiv kontrol i alle knockdown-assays. En række siRNA-koncentrationer fra 10 nM til 50 nM blev transficeret ved hjælp af dharmafect-transfektionsreagenset i overensstemmelse med leverandørens protokol. Ændringer i proteinekspressionsniveauer blev overvåget ved western blotting efter henholdsvis 24 timer, 48 timer og 72 timer (Supplerende figur 2). Nogle få flere mål (SH3PX1, AKT1, CCNB1 og SLC25A5) blev slået ned, og effekten af knockdown blev bestemt ved western blotting. GAPDH blev anvendt som belastningskontrol.

Knockdown af målproteinerne

Proteiner, der viste forstyrret tilknytning til Akt1, mens cellen udviklede sig fra G0 til G1/S-fasen i cellecyklus, blev knockdownet individuelt i HEK293-celler og undersøgt ved FACS. Hvert siRNA blev re-suspenderet i 1x siRNA-buffer for at opnå en stamkoncentration på 20 µM. Transfektion blev formidlet i tre eksemplarer 24 timer efter celleudsåning; sammen med passende positive og negative kontroller. Hvert siRNA blev fortyndet til en arbejdskoncentration på 25 nM i RPMI til et slutvolumen på 50 µl og opbevaret ved stuetemperatur i 5 minutters inkubation. Ligeledes blev transfektionsreagenset også fortyndet i RPMI til et volumen på 50 µl og opbevaret til inkubation under lignende forhold. Både siRNA og transfektionsreagens blev blandet forsigtigt for at danne komplekser, og inkubationen fortsatte i yderligere 20 minutter ved stuetemperatur. Det endelige volumen blev gjort op til 500 µl med medier indeholdende 10 % serum. Disse komplekser blev derefter forsigtigt tilsat til cellerne og fortsat inkuberet ved 37 °C. Cellekulturmediet blev erstattet med frisk 10 %-medie efter 24 timer. Endelig blev transfektionseffektiviteten 48 timer efter transfektion bestemt ved at overvåge siGLO under Nikon Ti inverteret mikroskop.

FACS opsamling og analyse

48 timer efter transfektion blev cellerne kortvarigt centrifugeret, og medierne blev suget op. Cellerne blev farvet med 300 µl propidiumjodidopløsning indeholdende 0,1 mg/ml propidiumjodid (Sigma), 3 µl/ml Triton-X 100 (Sigma), 1 mg/ml natriumcitrat (Sigma) og 20 µg/ml RNase (Sigma) i 30 minutter ved 4 °C. De farvede celler blev straks overført til BD FACS-rør og optaget i BD FACS Canto.

De opnåede data blev analyseret ved hjælp af FlowJo-software. DNA-histogrammer blev analyseret for at kvantificere sub G0-, G0/G1-, S- og G2/M-populationer. Der blev observeret mindre forskydninger i G0/G1- og G2/M-populationerne, og derfor blev der foretaget manuel gating for at analysere disse populationer.

PDT- og RT-beregning

PDT og RT i G1-, S- og G2-faserne i cellecyklusen blev beregnet efter siRNA-knockdown af det sæt proteiner, der viste forstyrret association med Akt1 i G1/S-fasen. PDT for de 23 gener blev sammen med kontroller overvåget i HEK293-celler over 72 timers varighed. Kort fortalt blev 10 000 celler udsået i en 96-well-plade i 100 µl RPMI-medie med 10 % serum. siRNA-transfektion blev formidlet den næste dag i tre eksemplarer for hvert målprotein og blev betragtet som 0 timers tidspunkt. Celtallene blev bestemt for ubehandlede HEK293-celler ved hjælp af trypanblå farvningsmetoden. Efter 24 timer blev cellekulturmediet indeholdende siRNA-komplekser erstattet med frisk RPMI indeholdende 10 % serum. Herefter blev cellerne talt for hver af de siRNA-transficerede celler for at repræsentere 24-timerstidspunktet. Herefter blev et sæt celler, der kørte i parallelkultur, høstet og talt ved henholdsvis 48 og 72 timers tidspunkter.

Når PDT var bestemt for alle de målrettede sæt af forstyrrede gener, blev RT (i timer) for hver af dem beregnet for G1-, S- og G2-fasen som følger:

where; % population af celler blev bestemt ved FACS-opsamling.

Datatilgængelighed

Massespektrometri-dataene blev deponeret som et datasæt “Defining the Akt1 interactome and delineating alterations in its composition as a function of cell cycle progression.” til ProteomeXchange via PRIDE-databasen. De er offentligt tilgængelige via ProteomeXchange med identifikator ProteomeXchange: PXD005557. Datasættet består af 12 råfiler (wiff og wiff.scan) og tilhørende 18 proteinpilotfiler.