6.2.3 Cowpea Mosaic Virus

Cowpea mosaic virus (CPMV; Comovirus, Comoviridae) er den mest omfattende undersøgte platform for forskellige konjugationer og bioteknologiske anvendelser. Det er et 30 nm icosaedrisk virus og består af et todelt positiv-sense, enkeltstrenget RNA-genom, hvor hvert RNA-molekyle er encapsideret i en separat partikel. CPMV-kapsiden består af 60 kopier af hver af to forskellige CP-underenheder (betegnet som lille, 24 kDa, og stor, 42 kDa) med pseudo T = 3 icosaedrisk symmetri. På grund af tilstedeværelsen af den meget symmetriske og heteromeriske natur af capsidet giver CPMV en bemærkelsesværdig mulighed for differentielt at indføre (på femdobbelt eller tredobbelt eller begge positioner) flere typer funktionaliteter ved specifik genetisk og kemisk teknik med kontrol over både den rumlige fordeling og graden af multivalens (Uchida et al., 2007; Young et al., 2008; Steinmetz, 2010; Wen et al., 2016). CPMV kan oprenses i store mængder fra inficerede blade og er stabilt i et bredt temperaturområde (op til 60 °C) og i pH-området 3,0-9,0 og kan tåle nogle organiske opløsningsmidler (Steinmetz et al., 2009). CPMV-kapsider anvendes til kontrolleret immobilisering af aktive enzymer. Udnyttelse af CPMV-kapsiden til templated fremstilling af metalliske nanopartikler ved hjælp af en ELD (electroless deposition) og mineralisering ved en række forskellige processer gjorde det muligt at fremstille tynde lag af metaller og legeringer med ensartet tykkelse og sammensætning. CPMV-virioner anvendes som nanobygningsblokke til kontrolleret konstruktion af 2-D og 3-D strukturer ved hjælp af en bottom-up, lag-for-lag (LbL) tilgang til potentielle anvendelser som nanoelektroniske enheder eller elektrokemiske multiple biosensorer (gennemgået i Culver et al., 2015; Wen et al, 2015a, 2016; Narayanan og Han, 2017a).

Native CPMV- og CPMV-partikler, der er derivatiseret med lanthanidmetalkomplekser, blev fundet sikre og ikke-toksiske, baseret på biodistribution, toksicitet og patologiske undersøgelser af disse partikler in vivo (Rae et al., 2005; Singh et al., 2007). CPMV blev fundet at være forbundet med regioner med inflammation og induceret blod-hjernebarriereforstyrrelser under infektion i centralnervesystemet (CNS) hos mus (Shriver et al., 2009). CPMV med overflade-PEGylering har vist lav immunogenicitet, og internalisering blev forhindret i flere celletyper på grund af reduktion i uspecifik binding (Raja et al., 2003). Manchester og medarbejdere opdagede, at fluorescerende mærket CPMV har en endogen kapacitet til at blive optaget af vaskulære endotelceller og kan bruges som en intravital billeddannelsessonde til at visualisere vaskulaturen og blodgennemstrømningen til en dybde på op til 500 μm i 72 timer i levende muse- og kyllingeembryoner (Lewis et al., 2006). CPMV viste sig at have en naturlig evne til at binde sig til overfladevimentin, et cytoskeletalt protein, der modulerer cellers arkitektur og dynamik, og det blev fundet at være overudtrykt i endothelceller, kræftceller og inflammatoriske celler (Koudelka et al., 2009). CPMV’s biokompatible, naturlige interaktion med vimentin og endotheliumretentionsegenskaber er blevet yderligere udnyttet til at afbilde tumorangiogenese og tumorhoming in vivo (Leong et al., 2010; Steinmetz et al., 2011; Yildiz et al., 2011; Wen et al, 2015a).

Den ydre overflade af CPMV-kapsiden er blevet omfattende modificeret ved hjælp af naturligt forekommende eller genetisk manipulerede eksponerede lysin-, cystein-, tyrosin- og asparaginsyre- og glutaminsyrerester ved hjælp af standard kemiske konjugationsmetoder og konjugerende cross-linkers til at fastgøre flere reagenser såsom Au-nanopartikler, redoxreaktive methylviologendele, organometalliske ferrocencarboxylatdele, fluorophorer, biotin, PEG-kæder, stilbenderivater, kulhydrater, heterologe proteiner (f.eks.g., humant holo-transferrin, T4 lysozym, LRR-domianen af internalin B og Intron 8-genproduktet af HER2 tyrosinkinase-receptoren), antistoffer, oligonukleotider, halvlederkvantepunkter og fullerener. Indarbejdelse af unaturlige aminosyrer i CPMV-kapsiden blev foretaget ved hjælp af flere ortogonale kemier (f.eks. kemoselektiv hydrazon-ligeringsstrategi og kobberkatalyseret azid-alkyne-cycloaddition (CuAAC) eller “klik”-reaktion). Disse bestræbelser har gjort det lettere at anvende CPMV-partikler som optiske sonder, vaccinekandidater og hukommelses- og sensornanodedele (gennemgået i Young et al., 2008; Destito et al., 2009; Grasso og Santi, 2010; Steinmetz, 2010; Lomonossoff og Evans, 2011; Wen et al., 2015a; Zhang et al., 2016; Lee et al., 2016b; Narayanan og Han, 2017a). CPMV og TMV blev indlæst til at bære kontrastmidler til dual-modalitet magnetisk resonans (MR) og optisk billeddannelse, og begge modaliteter viste specificitet af fibrinbinding in vitro med tilstedeværelsen af målrettede peptider. Prækliniske undersøgelser i en fotokemisk skade-model af trombose i en carotisarterie bekræftede, at nanosonderne var trombosemitterende, idet de aflange TMV-stænger udviste signifikant større vedhæftning til thrombi end icosahedral CPMV (Wen et al., 2015b,c). CPMV dekoreret med E7p72-peptider (høj affinitet epidermal vækstfaktorlignende domæne 7 (EGFL7) bindende peptid, der specifikt er rettet mod humane endotelceller) målrettet mod tumor-associeret neovaskulatur med høj specificitet som vurderet ved intravital billeddannelse (Cho et al., 2017).

In vitro og in vivo samlingsprotokoller for CPMV capsidunderenheder er endnu ikke godt etableret. Dette har begrænset dens potentiale til brug som en nanokontainer til indkapsling af lastmolekyler. Native nukleinsyreindhold i CPMV-virioner blev brugt som en elektrostatisk svamp til at tiltrække billeddannelsesmidler og terapeutiske molekyler via en simpel infusionsteknik (Yildiz et al., 2013). Transient coekspression af CPMV-prækursor (VP60), der består af fusionerede store og små proteiner, og 24K-proteinase til proteolytisk behandling af VP60 i planter resulterede i CPMV VLP’er (eCPMV), som var helt blottet for RNA (enten virus eller vært) (Saunders et al., 2009). Sådanne tomme kapsider er blevet brugt til at bære en lang række lastmolekyler, såsom metaller, fluorescerende farvestoffer eller lægemidler (Culver et al., 2015; Wen et al., 2015a; Narayanan og Han, 2017a). Fluorophorer, biotinaffinitetsmærker, PEG og forskellige peptider er blevet selektivt vist på den indre overflade af den tomme CPMV ved at målrette mod reaktive lysiner (Wen et al., 2012b). Effektiviteten af eCPMV som en in situ-vaccine blev påvist i musemodeller af metastatisk melanom, brystkræft, æggestokkræft og tyktarmskræft, hvor den inducerede et antitumor-immunrespons ved at udløse aktivering og infiltration af neutrofile, hvilket resulterede i en kemo/cytokinprofil, der fører til aktivering af adaptiv immunitet. De fleste mus, der på ny blev angrebet med tumorer på den modsatte flanke, afviste fuldstændigt den på ny angrebne tumor (Lizotte et al., 2016). Intratumoral levering af magnetiske nanopartikler (mNP) for at inducere hypertermi og eCPMV i kombination forbedrede den lokale og systemiske tumorbehandlingseffekt (forsinkelse af sekundær tumorvækst (abscopal effekt) og modstandsdygtighed over for tumorrechallenge) i C3H-mus/MTG-B mammary adenocarcinom- og C57-B6-mus/B-16-F10 melanomcellecellemodellerne (Hoopes et al., 2017a). Ved hjælp af otte spontane cancersygdomme hos hunde (to orale melanomer, tre orale amelioblastomer og et karcinom) viste Hoopes et al. (2017b), at hypofraktioneret stråling og mNP-induceret hypertermi og intratumoral eCPMV-behandling i kombination viste sig at fremkalde forbedrede immunsvar.

For at bruge CPMV til målrettet levering af lægemidler til kræftceller og for at overvinde den naturlige interaktion mellem CPMV og pattedyrceller blev der anvendt en “klik”-reaktion til at konjugere PEG og folatliganddelen (CPMV-PEG-FA) til CPMV. Denne konjugering muliggjorde specifik målretning af CPMV til folatreceptorer (FR’er), der udtrykker HeLa- og KB-celler (Destito et al., 2007). Målretning af CPMV mod neuroblastomtumorceller blev opnået ved at modificere CPMV genetisk for at vise neuropeptid Y (NPY)-analogen (NPY) som en målretningsligand. Det blev vist, at CPMV-NPY interagerede specifikt med SK-N-MC-celler, der overudtrykte Y1-receptoren (Destito et al., 2009; Ma et al., 2012). Receptor-målrettet billeddannelse blev opnået ved at forankre korte peptidsekvenser (F56 og bombesin specifik for henholdsvis vaskulær endothelial vækstfaktorreceptor-1 (VEGFR-1)) og gastrin-frigivende peptidreceptorer (GRPR) til CPMV. Disse CPMV-baserede sensorer viste sig at være specifikke ved binding til de kræftceller, der overudtrykker disse receptorer på celleoverfladen (Brunel et al., 2010; Steinmetz et al., 2011). Wen og Steinmetz (2014) udviklede en bottom-up tilgang til syntese af CPMV-nanopartikler, dimere og assemblies indeholdende målretningsligander (cykliske RGD-peptider) og fluorescerende farvestoffer og fandt, at symmetrisk præsentation af RGD-peptider og dimerisering af nanopartikler øgede effektiviteten af kræftcellemålretning.

CPMV er med succes blevet anvendt til visning af flere heterologe peptider for at fremkalde immunrespons. Immunisering af dyr med hver af kimærerne inducerede et stærkt humoral immunrespons, der beskyttede mod udfordring fra det respektive patogen. Multivalent visning af antivirale molekyler og kulhydrater på CPMV gjorde det lettere at anvende dem til terapeutiske anvendelser (Lomonossoff og Evans, 2011; Koudelka et al., 2015; Hefferon, 2017). Aljabali et al. (2013) etablerede kovalent konjugering af dox til CPMV gennem enten en amidbinding eller en disulfidbro ved hjælp af lysin- eller cysteinrester på den eksterne overflade af CPMV. Den dox-belastede CPMV udviste en højere celledræbende effekt end fri dox, selv ved lave doser. CPMV modificeret med en korona af negativt ladede dendroner blev anvendt til at indlæse positivt ladede fotosensibilisatorer (til fotodynamisk terapi (PDT)). Dette hybride PDT-CPMV-bærersystem var effektivt til at dræbe både melanomceller og makrofager in vitro (Wen et al., 2016). For at overvinde de dosisbegrænsende uspecifikke toksiciteter af trivalent krom (et gavnligt mineralnæringsstof), som selektivt kan hæmme proliferationen af høj-glukose-inducerede humane aortiske glatte muskelceller (HASMC) in vitro, Chromchlorid blev indlæst i CPMV’s indre hulrum via infusion, og de resulterende CrCl3-belastede CPMV-partikler (CPMV-Cr) reducerede signifikant glukoseinduceret HASMC-proliferation og udviste antiaterogene virkninger under hyperglykæmiske forhold (Ganguly et al., 2016).