ABSTRACT

Forud for ligering skal hvert Okazaki-fragment, der er syntetiseret på den efterslæbende streng i eukaryoter, behandles nukleolytisk. Nukleasekspaltning finder sted i forbindelse med 5′-flapstrukturer, der er genereret via strengforskydningssyntese af DNA-polymerase delta. Der findes mindst tre DNA-nukleaser: Rad27 (Fen1), Dna2 og Exo1 er blevet impliceret i behandlingen af Okazaki-fragmentflaps. Hverken de enkelte nukleasers bidrag til syntesen af forsinkelsesstrenge eller strukturen af de DNA-intermedier, der dannes i deres fravær, er imidlertid blevet klart defineret in vivo. Ved betinget udtømning af lagging-streng-nukleaser og direkte analyse af Okazaki-fragmenter, der syntetiseres in vivo i S. cerevisiae, foretager vi en systematisk evaluering af Rad27, Dna2 og Exo1’s indvirkning på lagging-streng-syntesen. Vi finder, at Rad27 behandler størstedelen af lagging-strand-flapsene, med et betydeligt yderligere bidrag fra Exo1, men ikke fra Dna2. Når nuclease-spaltningen er nedsat, observerer vi en reduktion i syntesen af strandforskydninger i modsætning til den udbredte dannelse af lange Okazaki-fragment 5′-flaps, som forudsagt af nogle modeller. Ved hjælp af cellecyklusbegrænsede konstruktioner viser vi endvidere, at både den nukleolytiske behandling og ligeringen af Okazaki-fragmenter kan afkobles fra DNA-replikation og forsinkes, indtil efter at syntesen af størstedelen af genomet er afsluttet.