Aminoglycosider: Perspektiver på virkningsmekanismer og resistens og strategier til bekæmpelse af resistens
STRUKTURELLE GRUNDLAG FOR AKTIONSMÆCANISME
16S rRNA fra Escherichia coli er velundersøgt blandt rRNA-underenhederne, og især er interaktionerne mellem forskellige aminoglykosidantibiotika og 16S rRNA og deres virkninger på processen med oversættelse af mRNA til polypeptid blevet undersøgt (35). Der findes lignende rRNA-strukturer i andre organismer som f.eks. gær og Tetrahymena (33). Behandling af rRNA med et aminoglykosid beskytter flere nukleinbaser i rRNA mod kemisk modifikation, hvilket indebærer, at disse molekyler har en høj affinitet for visse steder i rRNA. Noller (35) sammenlignede denne bindingsmåde med enzymhæmmere, som normalt binder sig til de aktive steder i enzymer og forstyrrer deres aktiviteter. Forskellige klasser af aminoglykosidantibiotika binder sig til forskellige steder på rRNA’et, afhængigt af den strukturelle komplementaritet mellem de to. For eksempel menes neomycin, paromomycin (fig. 1), gentamicin og kanamycin at binde til A-stedet på 16S rRNA’et i E. coli på samme måde og blev vist at beskytte baserne A1408 og G1494 i kemiske fodaftrykseksperimenter (fig. 2) (33). Fire baser, A1408, A1492, A1493 og G1494, i rRNA’s A-site interagerer med tRNA, om end med forskellig affinitet. Bindingen af de førnævnte aminoglykosider til A-stedet i afkodningsregionen (dvs. stedet for kodon- og anticodongenkendelse) forstyrrer den nøjagtige genkendelse af det beslægtede tRNA af rRNA under translation (35). Disse interaktioner menes også at forstyrre translokationen af tRNA fra A-stedet til peptidyl-tRNA-stedet (P-stedet).
(A) Stereobillede af den delvise struktur af 70S rRNA komplekset med tre tRNA-molekyler (Protein Databank-kode, 486D). A-site-regionen på 16S rRNA er vist i hvidt, hvor aminoacyl tRNA “A” (i gult) er bundet tæt på rRNA’s A-site. To andre tRNA’er, peptidyl- og exit tRNA’er, henholdsvis “P” (i rødt) og “E” (i grønt), er også vist. Rygsøjlen i den næstsidste stamme af 16S rRNA-molekylet og 900-loop’en er vist med violet. Paromomycinets bindingssted ved A-stedet er angivet med den hvide pil. (B) Stereovisning af opløsningsstrukturen af RNA A-site-skabelonen bundet af paromomycin, som omtrent svarer til A-site-regionen på 16S rRNA’et i hvidt i panel A. Connolly-overfladen af A-site-RNA’et er gengivet i overensstemmelse med det elektrostatiske potentiale ved hjælp af MOLCAD-programmet (Tripos, Inc., St. Louis, Mo.), og aminoglycosidet er vist i en kugle- og pindrepræsentation. Det mest elektronegative potentiale er gengivet med blå, og det mest elektropositive potentiale er gengivet med rødt på overfladen; alle andre farver viser potentialerne mellem blå og rødt. Pilen i hvidt viser det knæk, der er skabt af A1492, som ikke har en baseparringspartner. Pilen i gul viser den lomme, der er genereret af baseparret A1408 – A1493 og A1492. Pilen i rødt viser placeringen af 3-aminet på ring II, stedet for acetylering af AAC(3).
Puglisi og medarbejdere (12-14, 39) gav for nylig strukturelle beviser for interaktionsmåden for paromomycin, et repræsentativt aminoglykosid af neomycin-klassen, med en 27-nucleotid RNA-skabelon, der var designet til at efterligne A-site-regionen af 16S rRNA i E. coli (Fig.3A). Designet af RNA-skabelonen var baseret på tidligere viden om, at paromomycin interagerer med baseparret C1407 – G1494, A1408, A1493 og U1495, og at disse baser er absolut nødvendige for høj affinitetsbinding (39) (vist med gråt i Fig. 3A). Yderligere strukturelle træk, såsom den lomme, der er skabt af asymmetrien i den interne loop-region som følge af tilstedeværelsen af A1492 og baseparret C1409 – G1491 i den nederste stamme-region, er også vigtige. Disse strukturelle karakteristika skaber tilsammen en lomme, der er optimal til binding af paromomycin (se nedenfor).
(A) Model af A-site RNA-skabelonen, der er anvendt til undersøgelse af paromomomycins interaktioner. Kassen repræsenterer den del af rRNA’et, der er homologt med A-stedet. (B) RNA-aptamer-skabelon, der er anvendt til undersøgelse af tobramycins interaktioner.
I den native A-site RNA-skabelon har stammen baseparringsinteraktioner ved U1406 – U1495 (ikke-kanonisk) og C1407 – G1494 (fig. 3A). Ved binding af paromomycin stabiliseres den særskilte struktur dannet af A1408, A1492 og A1493 (fig. 2B), og baserne A1408 og A1493 danner et ikke-kanonisk basepar (12, 39). Nukleotid A1492, som ikke har nogen baseparringsinteraktioner, skaber et knæk i RNA-strukturen, og de kombinerede virkninger af A1492 og baseparret A1408 – A1493 skaber en udbuling i A-siden, hvor paromomycin binder sig og udvider knækvinklen yderligere (Fig.2B). De funktionelle grupper på paromomycin, såsom hydroxyl- og aminogrupperne, deltager i specifikke interaktioner med RNA-molekylet (se nedenfor).
Den lomme, der er skabt af A1492 og baseparret A1408 – A1493, er besat af ring II af paromomycin, og denne ring stabler sig over base G1491 (vist med en gul pil i Fig. 2B) (12). Ring I af paromomycin skaber specifikke kontakter med de “universelt” konserverede basepar U1406 – U1495 og C1407 – G1494 i rRNA. Det er bemærkelsesværdigt, at ring I er absolut nødvendig for specifik binding af aminoglykosidantibiotika til rRNA. Ringe III og IV i paromomycin udvider disse interaktioner yderligere ind i rRNA’s store rille. Amino- og hydroxyldelene bidrager hovedsagelig til de uspecifikke interaktioner mellem paromomycin og rRNA; de er således ikke sekvensafhængige interaktioner. Et andet vigtigt punkt er, at baseparret C1409 – G1491 giver plads til binding af aminoglycosidet i lommen, og et mismatchbaspar i denne position resulterer i tab af binding (12). Generelt binder aminoglycosider, der deler strukturelle træk med paromomycin, på samme måde til rRNA (13). Forskellige aminoglykosidantibiotika synes imidlertid at binde til det samme bindingssted i mere end én konformation (28). Den konformation af aminoglykosidet, der binder til RNA, skal i det væsentlige opfylde de elektroniske og steriske begrænsninger for bindingsstedet. I en anden undersøgelse af komplekset af gentamicin Cla og A-site RNA-skabelonen udviste ringene I og II af gentamicin Cla (som ligner dem af paromomycin) bindingsinteraktioner, der ligner dem i komplekset af paromomycin og A-site RNA-skabelonen (57). Ring III i gentamicin Cla interagerer imidlertid med baseparrene U1406 – U1495 og G1405 – C1496 i det øverste stammeområde (fig. 3A). Ud fra disse observationer foreslog Puglisi og kolleger (57), at alle de aminoglykosider, der er rettet mod A-siden af 16S rRNA’et, binder på en fælles måde, svarende til ringe I og II i paromomycin og gentamicin.
Selv om den overordnede struktur af rRNA er bevaret blandt alle arter i evolutionær forstand, er der forskelle, som gør binding af aminoglykosider mere specifik – med mindst 10 gange højere affinitet – til prokaryoternes rRNA end til eukaryoternes rRNA (19, 35, 38). Dette er ikke en stor forskel i bindingsaffinitet og kan til dels forklare de toksiske virkninger af disse antibiotika i pattedyrsystemer. Eukaryote rRNA indeholder et guanin i stedet for A1408, hvilket resulterer i et basepar G1408 – A1493. Desuden findes det matchende basepar C1409 – G1491 ikke i eukaryoter. Disse forskelle resulterer tilsammen i lavere affinitet af aminoglykosider for det eukaryote rRNA (12, 19, 35, 38). Efter at have skitseret disse forskelle ændrer binding af aminoglykosider til A-stedet af rRNA i prokaryoter A-stedets konformation og påvirker de specifikke interaktioner mellem mRNA og tRNA på dette sted, hvilket resulterer i fejlagtige kodon-anticodon-interaktioner. Der er til dato kun få strukturelle oplysninger om de specifikke aspekter af disse interaktioner på ribosomalt niveau (se nedenfor), men den klare og ultimative konsekvens er en forstyrrelse af translationsprocessen.
En anden strukturel undersøgelse blev udført på binding af tobramycin (Fig.1) til en RNA-aptamer (23). Den RNA-aptamer, der blev anvendt i denne undersøgelse, var et 26-nucleotid-stam-loop RNA (Fig. 3B). Der er fire mismatch-par, U7 – G20, G8 – U19, G9 – A18 og U11 – U16, i denne RNA-aptamer, som er en del af den lynlåseformede hårnålesløjfe. Tobramycin binder sig i denne rille, som er delvist indkapslet af overfladen af den dybe rille og guaninbasen på rest G15 (fig. 4). I dette kompleks sidder tobramycins ring I på bunden af den dybe rille. Den ene af aminogrupperne på tobramycins ring II interagerer med fosfatryggen i den dybe rille, og den anden aminogruppe er eksponeret for opløsningsmidlet. Ring III er placeret i midten af den dybe rille, og hydroxylgrupperne er rettet mod bunden af rillen. Konformationen af den ovenfor beskrevne RNA-aptamer blev foreslået som svarende til konformationen af hårnålesløjferne i tRNA og rRNA (23).
Stereovisning af komplekset af tobramycin bundet til RNA-aptameren. Den grønne Connolly-overflade repræsenterer en del af aminoglykosidbindingsstedet.
Den 7,5-Å-opløste røntgenstruktur af det funktionelle kompleks afT. thermophilus 70S rRNA indeholdende tRNA og mRNA er nyttig til at sætte ovenstående diskussion i perspektiv (5). Ud fra denne struktur kunne man forestille sig, hvor godt modelundersøgelserne med mindre RNA-skabeloner som tobramycin-RNA-aptameren og A-site-RNA med paromomycin (se ovenfor) ville passe ind i den komplette struktur af rRNA. A-site i 16S rRNA-underenheden af 70S rRNA ses nær grænsefladen mellem tRNA og 50S rRNA-underenheden, i nærheden af kodon-anticodon-parret (Fig. 2A). Ved sammenligning af opløsningsstrukturen af A-site RNA-skabelonen med A-site i røntgenstrukturen af 70S rRNA viste røntgenstrukturen sig at være nært beslægtet med den paromomycinbundne RNA-skabelon, men ikke med den native opløsningsstruktur af A-site RNA-skabelonen (5). Dette er interessant og tyder på, at bulen eller knækket nær baserne A1492 og A1493 måske i den funktionelle form altid findes i 70S rRNA. Hvis dette var sandt, ville det betyde, at bindingslommen for paromomycin allerede eksisterer, når 70S rRNA’et bliver funktionelt, og at det derfor er disponeret for hæmning af paromomycin. Dette modsiger påstanden om, at binding af paromomycin øger knækvinklen på bindingsstedet. Bevis til støtte for denne idé kommer fra en nylig undersøgelse, der tyder på, at affiniteten af forskellige aminoglykosider for A-site RNA-templaten er forskellig, og at disse antibiotikas evne til at hæmme proteinsyntesen in vitro også varierer (15). Gentamicin og flere andre beslægtede antibiotika interagerer med A-site RNA med dissociationskonstanter (Kd) i det mikromolære område, men de hæmmede en in vitro translationsproces med 50% hæmmende koncentrationer i det nanomolære område (15). Sidstnævnte fund blev udledt som et resultat af aminoglykosidbinding til det intakte rRNA i afkodningsregionen (A-site), og forskellen i bindingen til intakt rRNA kontra den til A-site skabelon-RNA kan skyldes forskellene i konformationerne af disse to RNA’er, som diskuteret ovenfor.
A-site skaber svage kontakter med mRNA og tRNA, hvilket indebærer, at denne region spiller en rolle i genkendelse af passende tRNA via subtile ændringer i den frie energi (5). Bindingen af aminoglykosid i nærheden af dette sted kan påvirke den delikate proces med interaktioner mellem kodon og anticodon. Det blev også foreslået, at tilstedeværelsen af et aminoglykosid stabiliserer komplekset af mRNA og tRNA ved A-stedet, hvilket igen påvirker translationsprocessen (5). Det er vanskeligt at formode alle aminoglykosidernes virkninger på rRNA-strukturen, og yderligere strukturelle undersøgelser med aminoglykosiderne bundet til komplekserne, såsom 70S rRNA, vil være nyttige til at belyse og forstå de subtile ændringer, der fører til aminoglykosidernes antibiotiske virkninger.
En række undersøgelser har anvendt syntetiske sonder til at forstå interaktionerne mellem RNA-templates og aminoglykosider. Det er blevet foreslået, at aminoglycosider binder til mere end ét målsted i ribozymet (6, 30). For nylig er flere aminoglykosidantibiotika såsom neomycin B, tobramycin og kanamycin A blevet dimeriseret enten symmetrisk eller asymmetrisk ved hjælp af en “tether”, og deres bindingsaffinitet er blevet sammenlignet med de monomere moderaminoglykosiders bindingsaffinitet (30). Det blev foreslået, at hvis der var flere bindingssteder på RNA’et, skulle de dimeriserede aminoglykosider binde med en højere affinitet end moderantibiotikaet, forudsat at der er adgang til flere bindingssteder. Det blev faktisk observeret, at de dimeriserede aminoglycosider binder 20 til 1 200 gange bedre til Tetrahymena-ribozymet end moderaminoglycosiderne. En forklaring på den højere bindingsaffinitet kunne være det øgede antal positivt ladede aminoglykosidgrupper på det dimeriserede aminoglykosid, men denne effekt synes at være synergistisk i forhold til den entropiske fordel, der opnås ved dimerisering (30). Det indikerede også tilstedeværelsen af flere højaffinitetsbindingssteder for aminoglycosidantibiotika i et RNA-molekyle. I en anden undersøgelse forsøgte man at udnytte paromomycinets RNA-bindingsegenskaber og den interkalerende adfærd hos visse forbindelser som f.eks. pyren og thiazolorange (48). I denne strategi blev aminoglykosider tænkt som et middel til at levere interkalerende stoffer til RNA. Konjugatet af paromomycin med thiazolorange eller pyren viste bedre bindingsegenskaber til den 27-nucleotiske A-site RNA-skabelon. Faktisk blev dissociationskonstanten for paromomycin-thiazolorange-konjugatet målt til 46 nM, hvilket blev rapporteret som den højeste affinitet, som rRNA A-site har vist for nogen ligand.
De strukturelle krav til RNA-binding af aminoglycosider indikerede, at en udbuling i RNA-sekvensen er nødvendig for at muliggøre binding af aminoglycosider (7). Ved at anvende et specifikt stam-loop-derivat af RNA-aptameren blev der udført en række kemiske interferens-, kemiske modificerings- og mutationsundersøgelser for at forstå de strukturelle krav til tobramycins binding af tobramycin til RNA-aptameren. Dette aminoglykosid viste sig hovedsageligt at interagere med nukleinbaserne i RNA-aptameren, men ikke med fosfatryggen. Tilstedeværelsen af en udbulning blev imidlertid foreslået som værende vigtig for tobramycins høje affinitetsbinding i et stoikiometrisk forhold, og det blev konkluderet, at en udbulning skaber et hulrum for interaktioner mellem aminoglycosidet og nukleinbasen (7). Denne analogi kan anvendes på andre RNA-steder som f.eks. hammerhead-regionen og A-stedet, hvor der findes et hulrum på grund af den ikke-kanoniske baseparring eller loops eller buler, der skaber et egnet sted for aminoglycosiderne til at interagere med de anioniske fosfatgrupper og nukleinbaserne. I forlængelse heraf fremsatte Westhoff og kolleger (49) et forslag om, at interaktionen mellem aminoglykosider og RNA sandsynligvis er formspecifik snarere end sekvensspecifik.
I overensstemmelse med dette koncept blev de elektrostatiske felter i RNA-foldningerne anset for at være den styrende kraft for bindingen (se nedenfor). Hermann og Westhoff (20) var i stand til at identificere dockingbekræftelserne af flere aminoglykosidantibiotika i forskellige RNA-skabeloner, såsom tobramycin-RNA-aptamerer og A-site-regionen i 16S-RNA’et, for hvilke der forelå strukturelle oplysninger. På grundlag af disse observationer blev aminoglykosidernes bindingsmåde til den trans-aktiverende responselementregion i HIV forudsagt (20). I en anden undersøgelse af RRE i HIV, bindingsregionen for Rev-proteinet, undersøgte Cho og Rando (8) den rolle, som en enkeltbaseudbulning og et hulrum spiller for binding af aminoglycosider. I overensstemmelse med tidligere hypoteser blev det udledt, at riller i RNA’s nonduplex-regioner er vigtige for høj affinitetsbinding af aminoglycosider til RNA. I dette tilfælde påvirkede den enkelte baseudbulning ikke bindingen, men hulrummet, et G-rigt område bestående af to ikke-kanoniske basepar og et enkelt udbulet U, har en høj affinitet for aminoglycosider. Ved at manipulere med hulrummet faldt RRE RNA’s affinitet for aminoglycosider, hvilket indikerer, at de ikke-kanoniske basepar indeholdende bulges er de primære aminoglycosidbindingssteder i denne RNA-skabelon (8).