Genterapi for ikke-arvelige lidelser

Der har været mange fremskridt i identifikationen af de mekanismer, der er involveret i kroniske organskader, som åbnede op for muligheder for genterapistudier. Mens et væld af prækliniske og kliniske undersøgelser i de seneste årtier har fokuseret på udvikling af genterapi til arvelige sygdomme, har der trods adskillige prækliniske undersøgelser i dyremodeller kun været få kliniske forsøg, der er blevet gennemført for at undersøge den terapeutiske effektivitet af genterapi til ikke-arvelige sygdomme. En nylig undersøgelse viser, at telomeraseekspression ved hjælp af AAV9-vektorer udøver terapeutiske virkninger i en musemodel af lungefibrose . Denne behandling var rettet mod idiopatisk lungefibrose. Det er kendt, at telomerer fungerer som beskyttende strukturer ved kromosomernes ender, og tilstedeværelsen af korte telomerer har vist sig at være en af årsagerne til sygdomsudvikling. I denne tilstand bliver telomererne for korte, hvilket medfører, at celledelingen ophører, hvilket igen fører til celleapoptose. Telomerase er et enzym, der kan omstrukturere telomerernes længde, og Povedano og kolleger har udviklet en behandling ved hjælp af AAV serotype 9 til at levere telomerase for at korrigere de korte telomerer. Da AAV9 fortrinsvis er rettet mod regenerative alveolære type II-celler (ATII), viser AAV9-Tert-behandlede mus en forbedret lungefunktion med reduceret inflammation og fibrose 1-3 uger efter vektorbehandlingen. Det er interessant at bemærke, at lungefibrose enten blev forbedret eller forsvandt efter 8 uger efter genterapi. AAV9-Tert-behandling førte til længere telomerer og øget proliferation af ATII-celler samt lavere DNA-skader, apoptose og senescens.

AAV-vektorafledt hjertelig genterapi er ved at opstå som en helt ny platform til behandling af hjertesygdomme . AAV-genterapi til hjertesvigt er blevet valideret i prækliniske undersøgelser ved hjælp af dyremodeller, og langt de fleste af disse tilgange er blevet iværksat for at forbedre calciumhåndteringen af kardiomyocytter. Det terapeutiske protein, der blev anvendt i de fleste af disse undersøgelser, var sarcoplasmatisk calcium ATPase (SERCA2a). På grundlag af de positive prækliniske resultater blev det første kliniske forsøg (CUPID-forsøg: calcium upregulation by percutaneous administration of gene vector in cardiac disease, NCT02346422) gennemført med henblik på at levere SERCA2a ved hjælp af AAV-serotype 1-vektor til behandling af patienter med fremskreden hjertesvigt . Resultatet af dette fase 1-forsøg var vellykket uden bivirkninger og blev videreført til fase 2a-studiet, der gav lovende resultater med en betydelig lav bivirkningsrate. Resultaterne af det kliniske fase 2b-forsøg (CUPID2b-forsøg, NCT01643330) med den samme vektor var imidlertid skuffende uden nogen signifikant ændring mellem behandlingsgruppen og placebogruppen . Dette har ført til, at rekrutteringen af patienter til to yderligere forsøg med AAV1.SERCA2a er blevet indstillet . Interessant nok er der to nye kommende forsøg, der har til formål at levere S100A1 med en AAV9-vektor og en konstitutivt aktiv form af proteinphosphatase 1-hæmmerne, I1c, med et chimært kapsid med AAV2- og AAV8-serotyperne . Desuden har AAV1, AAV6 og AAV9 vist sig at være de mest lovende AAV-serotyper til overførsel af hjertegener, hvilket giver håb om vellykkede genterapitiltag til behandling af hjertesvigt i fremtiden.

AAV-medierede genterapitiltag til behandling af neuropatiske smerter hos gnavere er også blevet rapporteret . Fischer og kolleger har vist, at administration af rAAV, der udtrykker Ca2+ kanalbindende domæne 3 (CBD3) genet, reducerede smerteadfærd som hyperalgesi efter berøring med en nål eller følsomhed over for acetonstimulering i dyremodeller af inflammatoriske og neuropatiske smerter betydeligt . En anden undersøgelse med AAV9-vektor, der kodede for kort hårnåle RNA (shRNA) mod vanilloidreceptor 1 (TRPV1), som er et vigtigt målgen for akut smerte, viste, at behandlingen dæmpede nerveskade-induceret termisk allodyni (øget respons fra neuroner) 10-28 dage efter behandling i en musemodel af spared nerve injury (SNI) . Disse resultater giver positive beviser, der tilskynder forskere i genterapi til at udvikle AAV-vektorbaserede behandlinger til patienter med kroniske/diabetiske neuropatiske smerter.

Der er gjort betydelige fremskridt inden for genterapi til behandling af kronisk leverfibrose. Selv om angiotensin-konverterende enzym (ACE)-inhibitorer eller angiotensinreceptorblokkere (ARB’er) er meget udbredt som behandlinger hos patienter med hypertension, er de blevet afprøvet hos patienter med kronisk leversygdom; resultaterne var dog ikke overbevisende, hovedsagelig fordi de producerer negative systemiske bivirkninger . På grund af manglen på medicinske behandlinger er levertransplantation uundgåeligt blevet den eneste mulighed for patienter med leversygdom i slutstadiet, som skyldes kronisk leverfibrose og/eller skrumpelever. Desuden betyder den stigende forekomst af kronisk leversygdom, manglen på donororganer, komplikationer efter transplantation og de høje omkostninger ved levertransplantation, at der er et stort behov for at opdage og formulere specifikke, effektive, sikre og billige nye behandlingsformer for leverfibrose/cirrhose.

En mulig tilgang til at omgå dette er at udvikle organmålrettede antifibrotiske strategier. Undersøgelser fra vores laboratorium tyder på, at et muligt mål er den “alternative akse” i renin-angiotensinsystemet (RAS), der omfatter dets nøgleenzym angiotensin-konverterende enzym 2 (ACE2), som nedbryder det potente profibrotiske octapeptid, angiotensin II (Ang II), til et antifibrotisk heptapeptid, angiotensin-(1-7) (Ang-(1-7)) . Beviser fra dyreforsøg viste, at rekombinant human ACE2 (rhACE2) er gavnligt til forebyggelse af hypertension ved hjerte-kar-sygdomme og til forbedring af nyrefunktionen ved diabetisk nefropati . Det er interessant, at rhACE2 blev godt tolereret af en gruppe raske frivillige mennesker i et klinisk fase 1-forsøg uden at udøve nogen uønskede kardiovaskulære bivirkninger . Der er en undersøgelse, der rapporterede terapeutiske virkninger af rekombinant ACE2 i eksperimentel leverfibrose, hvor leverskader blev kirurgisk induceret ved kolestase eller ved hepatotoksisk injektion af tetrachlormethan . De viste, at rekombinant ACE2 reducerede hepatisk fibrose signifikant i begge dyremodeller af leversygdom . En væsentlig ulempe ved denne systemiske fremgangsmåde er imidlertid, at behandlingen uundgåeligt medfører off-target-effekter, som i mange tilfælde er uønskede. Der er således flere ulemper ved systemisk administration af rekombinant ACE2. Dette omfatter daglige injektioner af ACE2, en procedure, der er invasiv i en klinisk sammenhæng og dyr tilgang med uønsket virkning på blodtryksreguleringen . For at omgå dette problem ville en ideel fremgangsmåde være at øge de vævsspecifikke ACE2-niveauer i målorganet. Således forventes organspecifik øget ACE2-aktivitet ved hjælp af en leverspecifik rekombinant AAV-vektor at producere terapeutiske virkninger, der er begrænset til målorganet, samtidig med at uønskede off-target-effekter minimeres.

Ud over brugen af leverspecifik capsid-serotype kan specificiteten yderligere forbedres ved at konstruere vektoren med ACE2-genet under transkriptionskontrol af en stærk leverspecifik promotor, apolipoprotein E/human α1-antitrypsin. Undersøgelser offentliggjort af vores laboratorium anvendte en pseudotypet leverspecifik AAV-vektor (rAAV2/8) til præklinisk evaluering og fandt, at hepatisk overekspression af murint ACE2-gen leveret til musene varede i op til 6 måneder efter en enkelt intraperitoneal injektion . Vi behandlede derefter mus med en række leversygdomsmodeller, som omfattede galdefibrose induceret af galdegangsligation (BDL), toksisk skade induceret af kulstoftetrachlorid (CCl4) injektioner og fedtlever-associeret leverfibrose induceret ved fodring med methionin- og cholin-deficient (MCD) diæt ved hjælp af en enkelt intraperitoneal injektion af rAAV2/8-ACE2 . Behandlingen gav en betydelig stigning i ACE2-ekspression og proteinaktivitet, som var begrænset til leveren uden at påvirke andre større organer. I modsætning til arvelige sygdomme, f.eks. hæmofili B, hvor et relativt lavt niveau af transgenekspression i leveren kan være tilstrækkeligt til efterfølgende små stigninger i FIX-niveauet i blodet , kan størrelsen af den transgenekspression, der er nødvendig for terapeutisk indgriben ved ikke-arvelige sygdomme, være betydeligt højere. Dette kan til gengæld udgøre en udfordring for forskere i genterapi. Interessant nok fandt vi imidlertid i vores levermålrettede terapeutiske tilgang med rAAV2/8-ACE2, at øget hepatisk ACE2-ekspression reducerede det hepatiske niveau af profibrotisk Ang II med mere end 50 % sammenlignet med dem, der blev behandlet med en kontrolvektor, der bar humant serumalbumin (rAAV2/8-HSA) . En reduktion af Ang II, som blev ledsaget af stigninger i hepatiske niveauer af antifibrotisk Ang-(1-7)-peptid, resulterede i en markant reduktion i inflammatorisk cytokinekspression, hvilket førte til en dybtgående reduktion af hepatisk fibrose i alle tre modeller (Figur 2) . Disse undersøgelser med kortvarige dyremodeller er blevet yderligere valideret for at give bevis for, at i langvarige dyremodeller af galdefibrose og fedtleversygdom, som giver leverlæsioner, der mere svarer til dem, der ses hos patienter med sådanne sygdomme, forårsagede en enkelt intraperitoneal injektion af rAAV2/8-ACE2 en dybtgående reduktion af leverfibrose (Figur 3). I markant kontrast til andre undersøgelser med AAV-vektorer , fandt vi, at rAAV2/8-ACE2 reducerede serum alanin transaminase (ALT) niveauerne i syge dyr sammenlignet med dem, der fik kontrolvektoren (rAAV2/8-HSA), hvilket tyder på, at selve vektoren er sikker i leveren. Desuden gav rAAV2/8-HSA (op til 10 dage) eller rAAV2/8-ACE2 (op til 24 uger) vektor, der blev injiceret i raske mus, ingen ændring i plasma ALT-niveauet, hvilket bekræfter, at det er usandsynligt, at vektoren i sig selv forårsager leverskader . Den skematiske fremstilling af den molekylære mekanisme i forbindelse med ACE2-genterapi ved hjælp af rAAV2/8-vektor i leverfibrose er vist i figur 4.

Lever-targeted genoverførsel ved hjælp af rAAV2/8-vektor har vist sig at være terapeutisk lovende i voksen lever, men deres virkninger er ikke blevet undersøgt udførligt i den umodne lever. Selv om rAAV2/8 transducerer neonatale muselever med høj effektivitet, er vektoren ikke persistent i leveren og aftager hurtigt med levervækst . Derfor kan en vellykket anvendelse af rAAV2/8-medieret terapi til behandling af leversygdomme i den tidlige barndom kræve genadministration . I tråd med dette viste en anden undersøgelse, at behandling af ornitin transcarbamylase (OTC)-deficiente neonatale mus med AAV2/8-OTC-behandling ikke beskyttede musene mod hyperammonæmi i voksenalderen . Således er fremstilling af stabil transduktion i den udviklende lever fortsat en af de største udfordringer for leverspecifik rAAV2/8-genterapi, og genadministration af vektorer kan være nødvendig for at opretholde terapeutisk effektivitet i voksenalderen efter tidlig neonatal behandling.

Selv om de AAV-vektorer, der anvendes til prækliniske undersøgelser, kan være effektive i menneskelig lever, er det vigtigt at vælge en AAV-vektor specifik for humane hepatocytter med øget transduktionseffektivitet . For nylig har to grupper foreslået at anvende humaniserede mus såsom den immunosupprimerede FRG (Fah-/-/Rag2-/-/-/Il2rg-/-) musemodel til at identificere den bedste rAAV-serotype til leverrettet genterapi . Undersøgelserne i den humaniserede musemodel, der er genbefolket med over 25 % humane hepatocytter, gjorde det muligt for forskerne at identificere AAV-vektorer, der er specifikke for den menneskelige lever, såsom LK-03, der stammer fra et kapsid-DNA-shuffled AAV-bibliotek. Dette bibliotek blev genereret ved hjælp af 10 AAV-kapsidegener. LK-03, som består af fem forskellige AAV-kapsider, var i stand til at transducere menneskelige primære hepatocytter med højere effektivitet in vitro og i en xenograftmodel for hepatocellulært karcinom in vivo sammenlignet med AAV-serotype 8 . Wang og kolleger rapporterede også et højere levertransduktionsniveau i FRG-mus ved hjælp af capsid af AAVrh10, en AAV af klade E, der stammer fra rhesusmakak, og AAV3B, og har vist, at AAV-LK-03-vektorer kan være bedre end AAV3B eller AAV8 . Det forventes, at forskerne i stigende grad vil anvende humaniserede dyremodeller til andre sygdomme end leversygdomme, hvilket vil give dem mulighed for at identificere nye varianter af konstruerede AAV-vektorer, transduktionseffektivitet og immunreaktioner, der er specifikke for det humane væv, der undersøges. Det er desuden blevet rapporteret, at AAV3B-eGFP-vektoren, som var i stand til at forårsage leverspecifik robust GFP-ekspression i leveren hos ikke-menneskelige primater, er betydeligt bedre end AAV8 uden nogen tilsyneladende hepatotoksicitet .