Proteiner har brug for at interagere med andre proteiner for at danne funktionelle komplekser. I mange tilfælde kan proteinernes funktion i cellerne ikke forstås uden oplysninger om proteinstrukturen og viden om, i hvilket kompleks proteinet befinder sig.1, 2 Dette er f.eks. af største betydning for proteiner, der modulerer epigenetisk information på DNA. Næsten alle disse kromatin-modificerende proteiner kræver intensiv interaktion med metaboliske enzymer, som leverer de cofaktorer, der er nødvendige for histonacetylering, deacetylering eller methylering og demethylering.3-5 Dette viser behovet for at undersøge et givet proteins komplekse miljø for at analysere dets funktion og aktivitetstilstand. Krydsbinding af proteiner i kombination med analyse ved massespektrometri (XL-MS) er ideelt egnet som en metode til at få oplysninger om proteinstruktur og sammensætningen af proteinkomplekser.6-9 Til XL-MS kræves der specialiserede kemiske reagenser, krydsbindingsmidler, som er i stand til kovalent at forbinde proteinrester, der er tæt på hinanden, f.eks. interagerende i et kompleks.10, 11 Karakterisering af de krydsbundne peptider ved hjælp af massespektrometri udgør imidlertid en formidabel udfordring af to grunde. For det første skal crosslink-identifikation opnås ved at analysere fragmentioner af ikke blot ét, men to forbundne peptider, hvilket komplicerer MS2-spektre massivt. For det andet har de tværbundne peptidarter kun en meget lille forekomst og er en del af en peptidblanding, der overvejende domineres af ikke-krydsbundne peptider. I mange tilfælde fører dette til et dramatisk informationstab, som hæmmer en præcis krydsbindingsidentifikation og dermed en interaktomanalyse. Der blev udviklet nogle få krydsforbindelsesreagenser, som introducerede MS-spaltbare grupper og muligheden for XL-berigelse for at løse disse problemer.12-18

Heri rapporterer vi om udviklingen af et nyt krydsforbindelsesreagens, som kan beriges og har spaltningsegenskaber, der muliggør præcis krydsforbindelsesidentifikation. Den udviklede cliXlink (1) er afbildet i figur 1. Det cellepermeable reagens (figur 1 A og figur S1 i den understøttende information) har to succinimidylesterenheder, der kan reagere med nukleofile stoffer i proteiner og er placeret med en afstand på ca. 9 Å fra hinanden, hvilket gør det muligt at fiksere korte afstande for at få strukturel information om proteiner og fange proteiner i umiddelbar nærhed af hinanden. Effektiv MS-spaltbarhed sikres af den veletablerede sulfoxidgruppe, som kan spaltes under lav-energi kollisionsinducerede dissociationsbetingelser (CID) før peptidfragmentering. Desuden giver en alkyneenhed mulighed for at knytte en berigelsesenhed, f.eks. biotin, til de tværbundne steder ved hjælp af CuAAC-reaktionen.19

Anvendelse af krydsbindingsmidlet kan følge det arbejdsforløb, der er afbildet i figur 1 B. Det indebærer, at reagens 1 tilsættes til et komplekst proteom, hvorved afstandsoplysningerne i native tilstand for peptider i umiddelbar nærhed fikseres og bevares i hele det videre arbejdsforløb til MS-analyse. Affinitetsgruppen til berigelse fastgøres efter tværbindingen for at undgå interferens fra voluminøse berigelsesgrupper. Ved at modificere de tværbundne peptider på proteinniveau kan overskydende småmolekylære reagenser let fjernes ved acetoneudfældning. Dette efterfølges af enzymatisk fordøjelse af proteinerne. De tværbundne peptider mærkes på denne måde, f.eks. med biotin, hvilket gør det muligt at berige dem. Herefter analyseres de ved hjælp af massespektrometri. Da de enkelte peptidmasser i en krydsforbindelse ikke er umiddelbart tilgængelige, er det vanskeligt at bestemme krydsforbindelsen, især i komplekse prøver. Dette kræver anvendelse af MS-spaltbare reagenser, som letter MS2-identifikation ved at danne specifikke fragmentioner.20, 21 I bedste fald bør reagenset også muliggøre MS3-eksperimenter, hvilket kræver, at crosslinkeren spaltes før peptiderne. Dette gør det muligt at adskille peptiderne med henblik på individuel MS3-baseret identifikation. Vores reagens 1 indeholder β-hydrogenatomer på begge sider af sulfoxidet, således at fragmenteringen sker i to retninger, som vist i figur 1 C. Dette fører til en ren adskillelse af peptiderne (α, β) og genererer to fragmenter for hvert peptid: et alken og et sulfensyrefragment; sidstnævnte danner et thial ved vandtab. Dette giver to massepar med et karakteristisk Δm/z≈32. Det er vigtigt, at vi observerede, at fragmenteringsvej a (figur 1 C) var fremherskende. For α-peptidet er alkenfragmentet og for β-peptidet thialfragmentet derfor de vigtigste spaltningsprodukter. På grund af de asymmetriske spaltningsegenskaber bevares størstedelen af signalintensiteten på ét fragment pr. peptid, hvilket skulle give en fremragende følsomhed i MS3-eksperimenter.

Syntesen af reagens 1 er ukompliceret (skema 1). Udgangspunktet er den oxiderede disulfiddimer af homocystein 2, som behandles med 4-pentynoesyre for at give disulfid 3. Reduktiv spaltning af disulfidet og alkylering af de dannede thioler med methyl 3-bromopropionat giver sulfidforbindelse 4. Saponificering af begge methylestere til 5 og omdannelse af 5 til aktiveret bissuccinimidylester 6 efterfulgt af oxidation af thioetheren til sulfoxid giver reagens 1 i et samlet udbytte på 16 %. Af særlig betydning er det, at reagenset er meget rent, og at de reaktive esterenheder er på plads på begge sider. Delvis hydrolyse skal undgås. Dette blev sikret ved en sidste udfældningsrensning. Reagens 1 blev opløst i en blanding af ethylacetat og dichlormethan og udfældet ved tilsætning af hexaner.

Vi undersøgte dernæst MS-egenskaberne af 1. Til dette formål tilsatte vi 1 til det almindeligt anvendte modelprotein, bovin serumalbumin (BSA). Vi fulgte den arbejdsgang, der er afbildet i figur 1 B, uden at udføre berigelsestrinet. Kort sagt, efter tilsætning af 1 til proteinopløsningen og reaktion i 1 time ved stuetemperatur og fysiologisk pH, udfældede vi proteinet med acetone, resuspenderede det i buffer (se Støttende information) og fordøjede proteinet efterfølgende med en blanding af trypsin og Lys-C.

Den opnåede peptidblanding blev afsaltet med C18 Tip-kolonner og analyseret ved hjælp af HPLC-MS2 (figur 2). Figur 2 A viser to tværbundne BSA-peptider (α+β) som et eksempel. Efter at have bestemt den nøjagtige masse af den intakte tværbinding (m/z 677,1; figur 2 B) udførte vi både CID- og HCD-fragmentering på forløberen for at evaluere fragmenteringsegenskaberne (figur 2 C). Mere selektiv CID-fragmentering (resonans excitation af crosslink-ionen; Figur 2 C, øverste spektrum) ved en lav normaliseret kollisionsenergi på 25 % giver som forventet kun et lille sæt af intense signaler. To fremtrædende signalpar med Δm/z på 32 (Δmrep) fås på grund af crosslinkerfragmentering, som resulterer i et thial- (α-/β-thial) og et alken- (α-/β-alken) fragment for hvert peptid. Som tidligere nævnt foretrækkes fragmenteringsvej a (figur 1 C), hvilket fører til en asymmetrisk intensitetsfordeling. Den dominerende dannelse af de forventede intakte, adskilte peptider gør følgelig reagenset egnet til mere sofistikerede MS3-eksperimenter.

For vores undersøgelse anvendte vi HCD-fragmentering. Denne metode giver samtidig spaltning af crosslinker og dannelse af de peptidfragmenter, der er nødvendige for identifikation (Figur 2 C, nederste spektrum). For at hjælpe med genkendelse af crosslink/peptid er det vigtigt, at HCD-fragmenteringen stadig giver alken- og thialfragmenter. HCD-dataene gør det derfor muligt at identificere peptiderne ved hjælp af MS2.

Med denne metode analyserede vi dataene med den frit tilgængelige MeroX-software, idet vi strengt filtrerede alle crosslink-identifikationer (score >50, false discovery rate (FDR) 1 %) og krævede tilstedeværelsen af mindst tre ud af fire ioner fra de to karakteristiske massepar.23, 24 Uden at udnytte muligheden for CuAAC-baseret berigelse var vi i stand til at identificere 61 unikke BSA-crosslinks i en enkelt måling (figur 2 D).25 Dette resultat er repræsentativt for målinger udført med renset BSA i vores laboratorium. Derudover afbildede vi de crosslinks, der blev fundet i BSA-krystalstrukturen, og bemærkede, at størstedelen af de målte afstande var rimelige. Det er vigtigt, at tværbindingerne viser en gennemsnitlig Cα-Cα-afstand mellem de tværbundne aminosyrer på 22,1 Å og en afstandsfordeling, der er i perfekt overensstemmelse med, hvad der forventes for tværbinding med et reagens, der mellemrummer de aktive estere med ca. 9 Å (figur 2 E og S2)26 og under hensyntagen til sidekædelængder og proteinets molekylære dynamik.27 Krydsforbindelsen fandt hovedsagelig sted mellem to Lys-rester (49 %), men vi påviste også Lys-Thr (30 %), Lys-Ser (13 %) og Lys-Tyr (8 %) forbindelser, hvilket er i overensstemmelse med succinimidylesternes reaktivitet (Figur 2 F).28

Denne succes gav os mulighed for at validere det nye krydsforbindelsesmiddel i et mere komplekst miljø. Vi ønskede især at vise den yderligere værdi af den CuAAC-baserede berigelsesmulighed. Til dette forsøg crosslinkede vi igen BSA-proteinet (10 μg), udfældede det med acetone, opløste det crosslinkede protein igen og udførte efterfølgende klikreaktionen (figur S3 A) ved at tilsætte 7 (figur 3 A) og CuSO4/tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amin (THPTA) efterfulgt af reduktion af CuII til CuI ved tilsætning af natriumascorbat. Efter 1 time ved stuetemperatur foretog vi endnu en acetonefældning for at fjerne overskydende biotinazid. Derefter blev der tilsat trypsin og Lys-C til fordøjelsen.

Disse peptider kombinerede vi dernæst med en proteindigest opnået fra et HEK-celleekstrakt (435 μg protein; figur 3 B). Dette skaber en massiv baggrund af ikke-krydsforbundne peptider. Hvis vi nu analyserede krydsforbindelserne inden for denne store baggrund (figur 3 C), identificerede vi kun et meget lille antal krydsforbindelses-spektralmatches (gennemsnitlig CSMs=5,0), unikke krydsforbundne steder (gennemsnitlig unik XLs=3,7) samt monolinks (gennemsnit=5,3), hvor den ene succinimidylester hydrolyseres inden reaktion med proteinet. Hvis vi imidlertid udførte berigelsen med streptavidinbelagte magnetiske perler, blev antallet af crosslink-identifikationer forbedret dramatisk. Efter inkubation af peptidblandingen med de magnetiske partikler, omfattende vask (6×) af perlerne med buffer (se Supporting Information) og mild, reduktiv spaltning af disulfidet for at frigøre de “indfangede” crosslinks og dermed fjerne biotindelen (figur S3 B), påviste vi nu i gennemsnit 95,0 CSM’er og 37,0 unikke XL’er sammen med 184,3 monolinks. Antallet af identificerede unikke XL’er var lavere end for den rensede BSA (figur 2 D), hvilket kunne forklares med ineffektivitet i CuAAC-reaktionen eller interferens fra den ikke-krydsforbundne kompleksbaggrund. Dette resultat viser imidlertid, at vores nye crosslinker, 1, er i stand til at berige tværbundne peptider i et stort overskud af umodificerede peptider, hvilket gør det lettere at analysere komplekse prøver med få tværbindinger. Oprindeligt var vi skeptiske over for den asymmetriske struktur af 1. Dataene viser imidlertid, at der på trods af dette identificeres et stort antal crosslinks.

Sammenfattende kombinerer vores nye crosslinker 1 følgende fordele: For det første er reagensets størrelse ideelt egnet til at opnå værdifulde afstandsoplysninger til strukturel proteomik. Desuden er molekylet cellepermeabelt, og alkyneenheden forårsager ikke større interferens med tværbindingsreaktionen. Desuden forenkler den robuste, effektive sulfoxidfragmentering tværbindingsidentifikation. Muligheden for at funktionalisere peptider, der er krydsbundet med 1 ved hjælp af klik-kemi, gør det muligt at anvende forskellige modifikationer og berigelsesstrategier, der gør det muligt at analysere krydsforbindelser med lavt indhold. Afslutningsvis kan det konkluderes, at vores reagens 1 nu baner vejen for kompleks interaktomanalyse ved hjælp af MS2- og MS3-eksperimenter.

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.