Zlepšení kvality spermií v hyperviskozním spermatu po ošetření DNázou I
Abstrakt
Hiperviskozita spermií zhoršuje jejich pohyblivost a může vést k mužské neplodnosti. Cílem této prospektivní studie bylo posoudit schopnost exogenní DNázy zlepšit kvalitu spermií s ohledem na to, že DNáza byla nalezena v semenné plazmě několika druhů a že neutrofily uvolňují chromatin za účelem zachycení bakterií. V této analýze bylo porovnáno celkem sedmdesát sedm vzorků spermatu s vysokou viskozitou spermatu (HSV) jako studijní skupina a šedesát dva vzorků spermatu s normální viskozitou spermatu (NSV) jako kontrolní skupina. Tyto vzorky spermatu byly rozděleny do tří skupin, které byly ošetřeny (a) DNázou I při 37 °C po dobu 15 minut, (b) centrifugací s gradientem hustoty a (c) kombinací obou výše uvedených metod. Po patnáctiminutovém ošetření hyperviskózního spermatu se motilita spermií u 83 % vzorků spermatu statisticky významně zvýšila. Naopak ošetření spermatu s normální viskozitou DNázou takové účinky nemělo. Uvedené ošetření bylo rovněž doprovázeno významným zvýšením procenta normálních spermií, což vedlo k významnému snížení indexu teratozoospermie. Srovnání vzorků spermatu, které byly po ošetření DNázou I podrobeny centrifugaci na hustotním gradientu, se vzorky odebranými po samotném ošetření na hustotním gradientu ukázalo, že v prvním případě byly výsledky spektakulárnější. Hodnocení jednotlivých preparátů z hlediska výtěžnosti (% celkového počtu progresivně pohyblivých spermií po ošetření ve vztahu k počátečnímu celkovému počtu spermií) ukázalo, že kombinovaný přístup vedl k získání 29,8 % oproti 18,5 % při samotném ošetření hustotou (p=0,0121). Léčba DNázou I vede ke zlepšení pohyblivosti a morfologie spermií a mohla by být přínosná pro muže s hyperviskozním spermatem v protokolech asistované reprodukce.
1. Úvod
Studie doložily, že hyperviskozita spermatu (SHV) se vyskytuje u 12-29 % ejakulátů . SHV je stav, který může vést k mužské neplodnosti , protože může vážně zhoršit fyzikální a chemické vlastnosti semenné tekutiny . Je spojena se sníženou pohyblivostí spermií a také se špatnými výsledky při oplodnění in vitro a zvýšenou produkcí reaktivních kyslíkových spekter (ROS). Kromě toho byly hladiny produktů oxidačního poškození spermií významně korelovány s viskozitou semenné tekutiny u neplodných mužů .
Existují silné náznaky existence inhibičních drah, které zhoršují kvalitu spermií prostřednictvím produkce ROS během transportu spermií mužským pohlavním traktem , náznaky poškození spermií během laboratorní manipulace a skladování , ale také náznaky další produkce ROS „automaticky“ po ejakulaci, přinejmenším v některých případech hyperviskozity spermií . Tento stav je většinou spojován s infekcí mužských přídatných pohlavních žláz a varikokélou , i když patofyziologie není dosud zcela objasněna. Dále byla v případech semenné hyperviskozity zjištěna zhoršená antioxidační kapacita semenné tekutiny v oligoastenozoospermických vzorcích . Nadměrně generované hladiny ROS navíc vyvolávají peroxidaci lipidů narušující morfologii membrán . Přítomnost zvýšeného množství leukocytů ve spermatu je spojena s SHV . Kromě toho jsou leukocyty hlavním zdrojem ROS a vektorů retrovirů ve spermatu , přičemž jejich přítomnost je spojena se sníženou pravděpodobností početí i nižší úspěšností intrauterinní inseminace (IUI) a konvenčního IVF . Kromě toho SHV koreluje se složením semenné mikrobioty a vyšší prevalencí patogenních bakterií .
V nastavení snížení viskozity spermatu SHV bylo navrženo několik terapeutických přístupů. Nadměrná hydratace a masáž prostaty nebyly účinné . Jemná aspirace a vypuzování spermatu prostřednictvím 5ml injekční stříkačky jsou téměř neúčinné, protože SHV není mechanický jev . Proteolýza pomocí chymotrypsinu zlepšuje manipulaci s hyperviskózním spermatem, i když dochází k určitým změnám v proteinech spermií . Vzhledem k tomu, že takový postup může poškodit strukturu spermií a že ve většině případů SHV koreluje s leukocytospermií , vyslovili jsme hypotézu, že SHV je způsobena extracelulárními pastmi neutrofilů (NET) a že jsou citlivé na degradaci DNA prostřednictvím DNázy I. Pokud je nám známo, jedná se o první zprávu o použití DNázy I za účelem řešení SHV.
2. Materiály a metody
2.1. Materiály a metody
2.1. Materiály a metody Účastníci
Prospektivní studie byla po dobu 3 let prováděna u pacientů s anamnézou neplodnosti na lékařské klinice v Aténách, Locus Medicus, s následujícími vylučovacími kritérii: varikokéla hypogonadismus, kryptorchismus a vrozená obstrukce semenných kanálků. Sedmdesát sedm vzorků spermatu s HSV bylo získáno jako studijní skupina a šedesát dva vzorků spermatu normálních s NSV bylo získáno jako kontrolní skupina, rozvrstvená následovně. Nejprve byla sada třiceti dvou vzorků spermatu HSV a deseti vzorků spermatu NSV ošetřena DNázou I. Dále byla další sada dvaceti šesti vzorků spermatu HSV a padesáti dvou vzorků NSV zpracována metodou centrifugace s gradientem hustoty (DGC). Nakonec bylo devatenáct vzorků HSV zpracováno kombinací metod, tj. prvotním ošetřením DNázou I a následnou DGC. Všichni účastníci před jakýmkoli zapojením podepsali informovaný souhlas.
2.2. Všichni účastníci byli informováni o svém zapojení do studie. Analýza spermatu
Vzorky spermatu získané masturbací po 3-5denní sexuální abstinenci byly umístěny do sterilních nádob. Po odběru byly vzorky spermatu ponechány zkapalnit při teplotě 37 °C a poté byly podrobeny konvenční analýze referenčních mezí analýzy spermatu, před a po kombinovaném procesu popsaném výše]. Pohyblivost hodnotil stejný úředně vyškolený (ESHRE) biolog, který se na studii nepodílí. Přítomnost bílých krvinek (WBC) byla hodnocena peroxidázovým testem (Leukoscreen FertiPro; Belgie) podle pokynů WHO 2010 . Ačkoli viskozita mohla být hodnocena kvantitativním viskozimetrem , viskoelasticita spermatu byla odhadována pomocí plastových jednorázových pipet, které umožňovaly kapání spermatu gravitací, a pozorováním délky případného vlákna . Muži, jejichž sperma mělo délku vlákna mezi 2 a 4 cm, byli klasifikováni jako muži s mírnou SHV (53,12 %); délka vlákna mezi 4 a 6 cm (40,62 %) byla označena jako středně těžká SHV; a délka vlákna větší než 6 cm byla diagnostikována jako těžká SHV (6,25 %), byli zařazeni do skupiny s vysokou viskozitou (HV), zatímco viskoelasticita byla považována za normální, pokud délka vlákna byla 2 cm nebo méně .
2,3 . Ošetření enzymem
Vliv DNázy I byl hodnocen u vzorků spermatu s normální a vysokou viskozitou. Po zkapalnění byla DNáza I jemně natáhnuta do sterilní nádoby se vzorkem spermatu na konečnou koncentraci 20 U/ml a neustále promíchávána, následovala inkubace při 37 °C po dobu 15 až 60 minut. Motilita a morfologie výše uvedených vzorků spermatu byla analyzována před a po enzymatickém štěpení a bylo vyhodnoceno % PR (pohyblivost (a+b) % z celkového počtu spermií) spermií před jakoukoli úpravou (tj. počáteční % PR).
2.4. V případě, že byly vzorky spermatu před jakoukoli úpravou ošetřeny, bylo vyhodnoceno % PR (pohyblivost (a+b) % z celkového počtu spermií). Příprava spermatu
Metoda centrifugace s gradientem hustoty (DGC) byla provedena podle doporučení výrobce. Hustotní gradient se připraví navrstvením 1 ml 40% média na 80% médium PureSperm® (Nidacon International, Göteborg, Švédsko) v 15 ml kónické centrifugační zkumavce. Sperma bylo navrstveno na horní část gradientu a centrifugováno při 300 g po dobu 20 minut. Rozsah a sílu odstřeďování lze měnit v závislosti na kvalitě vzorku: například u vzorků s vysokou viskozitou lze dobu odstřeďování prodloužit. Po odstředění je třeba opatrně odstranit většinu supernatantu a peletu umístit do nové čisté zkumavky a dobře resuspendovat v 5 ml média, aby se odstranilo médium hustotního gradientu. Poté se odstředí při 200 g po dobu 10 minut, odstraní se supernatant a konečná peleta se resuspenduje ve sterilním médiu pro asistovanou reprodukci (ART). Nakonec byly při kombinované úpravě vzorky s vysokou viskozitou nejprve ošetřeny DNázou I a poté připraveny výše popsanou metodou DGC. Byla stanovena koncentrace, pohyblivost a morfologie před a po přípravě.
Vzhledem k tomu, že celkový počet progresivně pohyblivých spermií (TPMSC) po promytí by mohl být užitečný pro předpověď účinnosti intrauterinní inseminace, byla výtěžnost každé metody vyhodnocena také takto: procento TPMSC po ošetření buď přípravkem DGC, nebo DNázou I, nebo kombinovaným ošetřením DNázou I s následnou přípravou DGC bylo vyděleno počtem všech spermií před ošetřením. Kromě toho byl výsledek výtěžnosti (tj. % konečných PR/celkový počet spermií před léčbou) porovnán s % počátečních PR/celkový počet spermií před jakoukoli léčbou. Výtěžnost byla hodnocena u vzorků spermatu s vysokou nebo normální viskozitou. Ačkoli neexistuje shoda ohledně počtu podaných pohyblivých spermií při ART , obecně se uznává, že zásadní význam má obnovení maximálního počtu pohyblivých spermií z každého vzorku spermatu po jakékoli léčbě.
2.5. Výtěžnost spermií při ART Statistická analýza
Data byla analyzována pomocí jednocestné ANOVA s následným vícenásobným srovnáním Kruskal-Wallisovým testem s použitím programu GraphPad Prism 6.0. Za statisticky významnou byla považována hodnota p menší než 0,05.
3. Výsledky
Koncentrace bílých krvinek (WBC) je znázorněna na obrázku 1. Mezi všemi skupinami je statisticky významný rozdíl (p=0,0238 jednocestná ANOVA). Navíc statistický rozdíl v rámci skupiny HV je 0,0018.
Koncentrace WBC (106/ml) v závislosti na délce vlákna viskozity (mírná, střední a silná) jako skupina HV; w/o V: sperma bez viskozity.
Použití DNázy I zvyšuje pohyblivost spermií u mužů (32 subjektů) s vysokou viskozitou. Jak ukazuje obrázek 2(a), přidání enzymu na patnáct minut (t=15) zlepší procento (a) pohybu z 2,875 % spermií na 8,094 % spermií bezprostředně po zkapalnění (t=0), což je statisticky významné (p=0,049, test mnohonásobného srovnání). Kromě toho se pohyb PR mezi stejnými časovými body zvýšil z 27,468 % na statisticky významných 46,59 % (p<0,0001, test mnohonásobného srovnání). Současně se pohyblivost frakce (c) snížila z 34,687 % (t=0) na 21,5 % (t=15) (p<0,0001, test mnohonásobného srovnání), zatímco pohyblivost frakce (d) se snížila z 37,812 % (t=0) na 31,968 % (t=15) (p=0,45 test mnohonásobného srovnání). Použití DNázy I ve spermatu s normální viskozitou nezvyšuje pohyblivost spermií statisticky významným způsobem, a to v žádném vzorku, jak je znázorněno na obrázku 2b).
(a)
(b)
(a)
(b)
Vliv DNázy I na pohyblivost spermií po 15minutové inkubaci s DNázou I. DNáza I statisticky významně zlepšuje pohyb PR v hyperviskozním spermatu (a), ale nemá žádný účinek u spermií s normální viskozitou (b). w/o: spermie bez ošetření, treated: spermie ošetřené DNázou I, a: rychle progredující spermie, b: pomalu progredující spermie, c: neprogredující, d: imobilní a PR: pohyblivost (a+b).
Pokračování inkubace po dobu dalších patnácti minut (u 21 subjektů z 32) (po celkovou dobu třiceti minut, t=30) zvýšilo pohyblivost části spermií na 9,524 % (t=30) z 1,761 % (t=0) (p=0,046, test mnohonásobného srovnání), jak ukazuje obrázek 3. Zajímavé je, že pohyb PR se dramaticky zlepšil z 24 % (t=0) na 45,047 % (t=30) (p<0,0001, test mnohonásobného srovnání) spermií. Pohyblivost (c) a (d) frakce spermií se statisticky významně snížila z 35,714 % na 22,08 % (p=0,001, test mnohonásobného srovnání), resp. ze 40,238 % na 32,238 % (p=0,039, test mnohonásobného srovnání). Přehodnocení viskozity spermií po ošetření DNázou I ukázalo, že ve většině případů se viskozita normalizovala nebo alespoň zlepšila.
Vliv DNázy I na motilitu hyperviskozního spermatu po 30minutové inkubaci s DNázou I. DNáza I zlepšuje pohyb statisticky významným způsobem u hyperviskozního spermatu, ale méně nápadně než patnáctiminutová inkubace. w/o: spermie bez ošetření, treated: spermie ošetřené DNázou I, a: rychle progredující spermie, c: neprogredující, d: imobilní a PR: pohyblivost (a+b).
Poté jsme porovnali výsledky spermií, které prošly centrifugací na hustotním gradientu po ošetření DNázou I, s výsledky zjištěnými po ošetření samotným hustotním gradientem. Vzhledem k limitům vzorků nebyly oba postupy použity na vzorcích získaných od stejných subjektů, ale na vzorcích od různých subjektů, jejichž spermie měly vysokou viskozitu. Úprava centrifugací s gradientem hustoty byla použita i při intrauterinní inseminaci (IUI). Jak je znázorněno na obrázku 4, procento (a) pohybu po hustotní gradientové centrifugaci po ošetření DNázou I se zvýšilo z 3,416 % na 35,083 % spermií (10,27násobné zlepšení) ve srovnání s 6,333 % na 26,866 % spermií (4,242násobné zlepšení) v případě samotného ošetření hustotním gradientem (p<0,0001, vícenásobné srovnání Kruskal-Wallisův test). Pokud jde o pohyb (b), po centrifugaci na hustotním gradientu po ošetření DNázou I bylo zlepšení rovněž statisticky významné (z 28,583 % na 40,916 % spermií (1,43násobné zvýšení), p=0,0112). Ve skupině s centrifugací na hustotním gradientu se příslušné zlepšení zvýšilo z 34,533 % na 46,466 % spermií (1,34násobné zlepšení), i když rozdíl mezi skupinami nebyl statisticky významný (ns, vícenásobné srovnání Kruskal-Wallisův test). Dále se pohyb PR v první skupině zvýšil z 32 % na 76 % spermií (2,375násobné zlepšení) ve srovnání s 1,776násobným zlepšením ve druhé skupině (ze 40,866 % na 72,666 % spermií) (nestatisticky významné mezi skupinami, vícenásobné srovnání Kruskal-Wallisův test). Motilita (c) a (d) frakce spermií se snížila z 36,083 % na 10,583 %, resp. z 31,916 % na 13,583 %. Příslušný pokles ve skupině ošetřené pouze centrifugací na hustotním gradientu byl z 29,40 % na 14,80 % (statisticky nevýznamné mezi skupinami, vícenásobné srovnání Kruskal-Wallisův test).
Srovnání DGC po ošetření DNázou I oproti samotné DGC v motilitě hyperviskózního spermatu. Kombinovaná léčba měla větší vliv na pohyb spermií než samotná DGC. w/o: sperma bez léčby, treated: sperma ošetřené DNázou I, a: rychle progredující spermie, b: pomalu progredující spermie, c: neprogredující, d: imobilní a a PR: motilita (a+b).
Vyhodnocen byl počet TPMSC po promytí ve vztahu k počátečnímu počtu (výtěžnosti) každého preparátu (M&M). Výtěžnost při ošetření hustotním gradientem v případě jedince bez viskozity spermatu byla 27,096 % (obr. 5, w/o V-d). Výtěžnost stejného přípravku v případě jedinců s vysokou viskozitou (obrázek 5, HV-d) byla 18,519 %. Změna v obou případech vzhledem k jejich příslušné kontrole (tj. obrázek 5, w/o V, HV) byla statisticky významná (p<0,0001, resp. p=0,0377, vícenásobné srovnání Kruskal-Wallisův test), což značí, že po léčbě DGC došlo ke ztrátě velkého množství PR spermií. Když byly spermie jedinců s vysokou viskozitou ošetřeny DNázou (obr. 5, HV-DNáza), byla odpovídající výtěžnost 42,47 %, zatímco porovnání ošetření hustotním gradientem (HV-d) a ošetření DNázou (HV-DNáza) vedlo k výsledku p<0,0001 vzhledem ke skupině HV, vícenásobné srovnání Kruskal-Wallisův test. Navzdory velikosti výše uvedeného úspěchu, kombinace ošetření DNázou, která je následována ošetřením gradientem hustoty (obrázek 5, HV-DNáza-d), výsledky k získání 29,782 % (p=0,0121 vzhledem ke skupině HV, vícenásobné srovnání Kruskal-Wallisův test). Kromě toho byl kombinovaný přípravek (HV-DNáza-d) porovnán s % PR spermií ve spermatu s vysokou viskozitou před jakoukoli úpravou (obrázek 5, HV) a výsledkem bylo p=0,448, což znamenalo, že byla získána většina PR spermií. Navíc ve srovnání se skupinou w/oV-d nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl jako p=0,619 vícenásobné srovnání Kruskal-Wallisovým testem.
Vyhodnocení výtěžnosti % (TPMSC po ošetření/celkový počet spermií před ošetřením) DGC, ošetření DNázou a jejich kombinace ve spermatu s vysokou nebo normální viskozitou. w/oV-d: sperma s normální viskozitou po DGC, HV-d: sperma s vysokou viskozitou po DGC, HV-DNase: sperma s vysokou viskozitou po ošetření DNázou a HV-DNase-d: sperma s vysokou viskozitou po ošetření DNázou, po kterém následovala DGC. w/oV: sperma s normální viskozitou před ošetřením; HV: sperma s vysokou viskozitou před ošetřením.
Další hodnocení morfologie spermií po patnáctiminutové inkubaci s DNázou I vede ke statisticky významnému zvýšení procenta normálních spermií z 5,468 % na 7,25 %, p=0,0197, jak je znázorněno na obr. 6. Zároveň došlo ke snížení abnormalit hlavičky z 81,75 % na 74,937 % (p=0,0004), zatímco abnormality krčku se snížily z 22,062 % na 19,343 % (p=0,0197). Abnormality ocasu a cytoplazmatické kapky mají stejný průběh. V důsledku těchto změn v morfologii je důvodné pozorovat významný dopad na index teratozoospermie (TZI). Jak je znázorněno na obrázku 6, došlo k jeho snížení z 1,205 na 1,084 (p<0,0001).
Patnáctiminutová inkubace s DNázou I zefektivňuje morfologii spermií a TZI spermatu s vysokou viskozitou. w/o: sperma bez ošetření, ošetřené: sperma ošetřené DNázou I, head abn: abnormality hlavy, tail abn: abnormality ocasu a TZI: index teratozoospermie.
4. Diskuse
V této studii jsme předpokládali, že hyperviskozita spermatu má původ v NET. Předložené údaje ukazují, že štěpení vytlačené DNA NET je proveditelné, což vede ke zlepšení pohyblivosti spermií. Enzymatické štěpení DNA semenné plazmy bylo zkoumáno s cílem zvýšit pohyblivost spermií, a tím je učinit vhodnými pro použití v ART. Použití DNázy I po zkapalnění spermií vedlo ke zlepšení motility i morfologie spermií. K dosažení nejlepších výsledků, kterých bylo dosaženo po 15minutové inkubaci, bylo použito několik inkubačních časů. Cílem studie bylo zlepšení výtěžnosti intrauterinní inseminace, a to v kohortě subfertilních mužů, jejichž spermie se vyznačují vysokou viskozitou způsobenou nejspíše překážkami způsobenými vytlačenou DNA. Použití DNázy I navíc zlepšilo abnormální morfologii, která obvykle koexistuje s vysokou viskozitou. Obohacení spermií bylo hodnoceno také podle konečného počtu izolovaných, rychle i pomalu progredujících spermií.
Statisticky významné zlepšení morfologie spermií po léčbě DNázou I může naznačovat, že tyto abnormality se materializují po ejakulaci a udržují se v důsledku vysoké viskozity. Vzhledem k tomu, že hyperviskozní sperma má sníženou celkovou antioxidační kapacitu , může přítomnost spermií v tomto prostředí vyvolat peroxidaci lipidů a poškození DNA a nakonec i zhoršení morfologie. Ukázalo se, že alespoň některé z těchto morfologických abnormalit jsou reverzibilní při ošetření DNázou I. Toto zlepšení naznačuje optimální použití výše uvedené léčby v případech, kdy není tak vysoký požadavek na velký počet přímo pohyblivých spermií, jako v případě intrauterinní inseminace, ale kdy je požadavek na co nejlepší morfologii, jako je tomu v případě IVF nebo postupu ICSI pro oplodnění .
Naše výsledky ukazují, že aplikace DNázy I je účinná pouze v přítomnosti hyperviskozity. Jak ukazuje obrázek 2b), v nepřítomnosti hyperviskozity použití DNázy I nepůsobí. Konkrétně za normální viskozity a bez ohledu na pohyblivost spermií nevedlo trávení enzymu k žádnému statisticky významnému rozdílu v žádném ze zkoumaných parametrů. Naopak v kohortě spermií s hyperviskozitou vedlo použití enzymu ke zlepšení motility PR statisticky významným způsobem, jak ukazuje obrázek 2(a). Kromě toho nebyly zjištěny žádné rozdíly v pohyblivosti a obnově morfologie spermií ve skupině HV podle těžké nebo střední viskozity, ačkoli počet vzorků spermatu s těžkou viskozitou byl nízký. Navíc, jak ukazuje obrázek 5, statisticky významný rozdíl po přípravě DGC mezi skupinou s vysokou viskozitou (HV-d) a skupinou s normální viskozitou (w/oV-d) je 0,0179, což naznačuje, že zlepšení je dosažitelné. Kromě toho je na stejném obrázku vidět, že výtěžnost kombinované léčby (HV-DNase-d) vedla k obnovení procenta PR spermií, které dosáhlo úrovně odpovídajících spermií u mužů s vysokou viskozitou (HV) před léčbou, protože konečné procento PR (29,782 %, HV-DNase-d) v prvním případě nemá statistický rozdíl oproti počátečnímu PR (26,478 %, HV před léčbou), p=0,4480. Význam tohoto kombinovaného přístupu, přestože snižuje výtěžnost ve srovnání se samotným ošetřením DNázou (p<0001 mezi HV-d a HV-DNázou), byl doložen skutečností, že ošetření hustotním gradientem odečítá od získaných, c) a d) třídy spermií protějšky, čímž je čistí. Naproti tomu odpovídající statistický rozdíl mezi výtěžností přípravku DGC (HV-d, 18,519 %) a „HV před úpravou“ (26,478 %) byl významný (tj. p=0,0322).
Navíc by mohl nahradit mechanickou úpravu hyperviskózního spermatu; proto se běžně ředí nebo natahuje do podkožní jehly a protlačuje, aby se překonala zvýšená viskozita. Ačkoli tyto metody pravděpodobně nebudou účinné, protože tento druh léčby zvyšuje produkci ROS . Kromě toho hyperviskozita negativně koreluje s integritou chromatinu jako defektní dekondenzace, což již bylo zaznamenáno .
Všeobecně byla aplikace DNázy I v dýchacích cestách již lékařsky schválena FDA v případě cystické fibrózy . Kromě toho je DNáza přirozenou složkou semenné plazmy, jejíž úlohou je pravděpodobně ředění NET vytvořených v ženském reprodukčním traktu po náboru neutrofilů v reakci na zánět, a navrhovaný postup je potenciálně lékařsky použitelný při ART. Jeho úloha je také posílena skutečností, že jeho absence má nepříznivé účinky na inseminaci primátů .
Hyperviskozita je pravděpodobně způsobena buď zánětem, nebo jakoukoli dysfunkcí semenných žláz, ačkoli přesný mechanismus není jasný. Mohla by souviset s virovými infekcemi pohlavního ústrojí, jak již dříve prokázala naše laboratoř . Bylo použito několik terapeutických protokolů s cílem snížit viskozitu spermatu, ale jen zřídka byly výsledky povzbudivé . Metody jako nadměrná hydratace a masáž prostaty nepřinesly očekávané výsledky . Použití proteolytických enzymů, jako je alfa-chymotrypsin, sice přineslo nadějné výsledky, ale jeho použití se neujalo .
V jiné studii byla ke snížení viskozity použita DNáza I , ale konečné výsledky nebyly v tomto ohledu úspěšné. Autoři nezkoumali kvalitativní parametry spermií, tj. pohyblivost. Navíc doba inkubace byla mnohem delší (jedna hodina) než námi navrhovaná (patnáct minut), takže neutrální vliv na viskozitu by mohl být pravděpodobně přičítán delší inkubaci enzymu se spermatickou plazmou.
Nakonec, navzdory údajům, že hyperviskozita spermatu byla korelována se zánětem mužského pohlavního ústrojí, tj, semennými váčky, což vedlo k používání antibiotik a antioxidantů, tyto formy terapie mohly tento stav léčit pouze v případech, kdy byl hlavním faktorem zánět. Obvykle je způsoben různými faktory, které působí synergicky, a proto neexistuje přímá kauzální terapie hyperviskozity .
Při vystavení zánětlivým podnětům uplatňují neutrofily, hlavní populace leukocytů ve spermatu, svou ochrannou roli prostřednictvím inaktivace bakterií fagocytózou a následným usmrcením působením proteolytických enzymů a ROS. Druhým způsobem působení, kterým mohou neutrofily neutralizovat patogeny, je produkce extracelulárních pastí neutrofilů (NET) . NET jsou trojrozměrné vláknité sítě tvořené převážně chromatinem, které mohou zachycovat a imobilizovat mikroorganismy. Bylo prokázáno, že NET jsou citlivé na degradaci DNázou, ale ne proteázou . Vzhledem k tomu, že tvorba NETs je založena na DNA a bylo prokázáno, že semenná DNáza štěpí vytlačenou DNA a uvolňuje zapletené spermie, předpokládali jsme, že použití exogenní DNázy by se mohlo ukázat jako cenná léčba v případech semenné hyperviskozity způsobené především přítomností extracelulární, obnažené DNA neutrofilů.
Z patofyziologického hlediska se téměř ustálila koncepce, která hyperviskozitu připisuje zánětu. Zánětlivé reakce zahrnují tvorbu NET z neutrofilů za účelem zachycení mikroorganismů. Je velmi pravděpodobné, že spermie spotřebovávají mnoho energie ve snaze osvobodit se z NETs, a proto je studium jejich oxidace a apoptotického stavu velmi důležité. Navíc již popsaný „trapping effect“ je důsledkem prevence pohybu spermií v důsledku jejich zapletení do NET.
V této studii jsme se pokusili lyzovat extracelulární DNA semenné plazmy, která je hlavní složkou NET, pomocí DNázy I s cílem uvolnit je z NET a obnovit kvalitativní parametry spermií, tj. pohyblivost a morfologii. Kromě toho, jak ukazuje obrázek 1, existuje statisticky významný rozdíl mezi koncentrací WBC a stupněm viskozity. Navrhovaná léčba je omezena na postejakulační fázi, nikoli na klinickou. Navíc byla ověřena původní hypotéza, že zvýšená viskozita spermií je důsledkem přítomnosti DNA ve spermatu, i když k potvrzení této hypotézy jsou zapotřebí další studie. Vzhledem k tomu, že rekrutované neutrofily tvoří NET na zánětlivých místech, předpokládali jsme, že DNA ve spermatu pochází z neutrofilů. Ačkoli jsme nepředložili přímý důkaz, který by tuto domněnku potvrzoval, domníváme se, že podle našich znalostí je hlavním možným zdrojem DNA chromatin neutrofilů, který je vytlačován při zánětu
5. Závěry
Výsledky naší studie podporují závěr, že léčba DNázou I přináší statisticky významné zlepšení pohyblivosti a morfologie spermií. Upravuje základní parametry spermií pro ART, tj. pohyblivost a morfologii, pouze v případě hyperviskózního spermatu. Naše zjištění navíc naznačují, že hlavní příčinou SHV je tvorba NET, a proto navrhujeme terapeutický potenciál a užitečnost tohoto přístupu.
Dostupnost údajů
Údaje použité na podporu výsledků této studie jsou na vyžádání k dispozici u odpovídajícího autora.
Etické schválení
Všechny postupy provedené v této studii a zahrnující lidské účastníky byly v souladu s etickými normami Bioetické a deontologické komise Lékařské fakulty Národní kapodistrijské univerzity v Aténách, schválenými v lednu 2014 (referenční číslo: 1130).
Souhlas
Všichni pacienti dali před svým zapojením do studie informovaný souhlas.
Konflikty zájmů
Všichni autoři deklarují, že nemají žádné konkurenční finanční zájmy.
Příspěvky autorů
Angelos D. Gritzapis a Vassilis Tsilivakos studii vymysleli. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis a Vassilis Tsilivakos provedli sběr dat, podíleli se na jejím návrhu a vypracovali rukopis. Effrosyni Nosi provedla imunoanalýzu a Angelos D. Gritzapis statistickou analýzu. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis, Konstantinos Makarounis, Georgios Georgoulias, Vasilios Kapetanios, Christodoulos Papanikopoulos, Anastasia Konstantinidou, Panagiotis Venieratos, Marighoula Varla-Leftherioti a Vassilis Tsilivakos se podíleli na analýze a interpretaci dat. Všichni autoři přečetli a schválili konečnou verzi rukopisu.
Poděkování
Tento projekt byl financován Klinickou diagnostickou laboratoří společnosti Locus Medicus S.A.
.