Abstrakt

Stromy rodu Copaifera pocházejí z tropických oblastí Latinské Ameriky a západní Afriky. Copaifera sp se hojně používá jako lidový lék a má různé etnofarmakologické indikace, včetně kapavky, bronchitidy, astmatu, kožních vředů, vředů, bolestí v krku, děložních infekcí, celkových zánětů, rakoviny a leishmanióz. Kyselina kaurenová je přirozeně se vyskytující diterpen, který se nachází v Copaifera a používá se jako protizánětlivý prostředek, k léčbě vředů, leishmaniózy a rakoviny. S ohledem na skutečnost, že Amesův test je vynikajícím nástrojem pro hodnocení bezpečnosti extraktů, silic a fytochemikálií izolovaných z léčivých rostlin, hodnotíme z něj mutagenní potenciál čtyř druhů, mezi oleoresiny (C. oblongifolia; C. langsdorffii) a extrakty listů (C. lucens; C. multijuga), rodu Copaifera a také kyseliny kaurenové, která je jednou z jeho hlavních sloučenin. Výsledky ukázaly, že Copaifera spp. a kyselina kaurenová nevyvolaly ve všech koncentracích hodnocených Amesovým testem zvýšení počtu revertantních kolonií bez mutagenního účinku v pokusech. Výsledky získané v naší studii podporují bezpečné používání vybraných léčivých rostlin rodu Copaifera a kyseliny kaurenové.

1. Úvod

V průběhu historie používaly různé kultury rostliny k léčebným účelům. Rostliny se skutečně osvědčily jako zdroj léčivých látek pro léčbu širokého spektra onemocnění. V současné době hrají rostlinné systémy i nadále zásadní roli ve zdravotnictví a zájem o fytomedicínské produkty celosvětově vzrostl natolik, že rostliny jsou stále zkoumány jako zdroj nových léčivých látek .

Stromy patřící do rodu Copaifera pocházejí z tropických oblastí Latinské Ameriky a západní Afriky. Rod Copaifera patří do čeledi Leguminosae a zahrnuje 72 druhů. Více než 20 druhů Copaifera se vyskytuje na území Brazílie, kde se jim říká „copaibeiras“, „pau d’óleo“ nebo „copaíbas“ . Copaifera spp. jsou hojně využívány v lidovém léčitelství. Mají různé etnofarmakologické indikace, jako je léčba kapavky, bronchitidy, astmatu, kožních vředů, vředů, bolestí v krku, děložních infekcí, celkových zánětů, rakoviny a leishmaniózy .

Vědecká literatura obsahuje četné zprávy o farmakologických účincích druhů Copaifera, jako jsou mimo jiné jejich protizánětlivé , protinádorové , antiproliferativní , anthelmintické , antituberkulózní , gastroprotektivní , chemopreventivní , imunomodulační a antibakteriální účinky.

Kyselina kaurenová je diterpen, který se přirozeně vyskytuje v některých brazilských rostlinách, včetně oleoresinů Copaifera. U kyseliny kaurenové bylo zaznamenáno nespočet farmakologických vlastností, například její protizánětlivý účinek, použití k léčbě vředů a její antiparazitický, analgetický a protinádorový potenciál .

Protože se přírodní sloučeniny tradičně používají, často se předpokládá, že jsou bezpečné. Mnoho studií však uvádí, že některé rostlinné druhy používané v tradiční medicíně vykazují mutagenní, karcinogenní nebo toxické účinky . Přesto se řada rostlin a fytoterapeutických přípravků nadále používá, aniž by byla vědecky prokázána jejich bezpečnost.

Amesův test je celosvětově známý svou schopností odhalit bodové mutace způsobené různými činiteli. Tento test využívá indikativní kmeny Salmonella Typhimurium, které jsou citlivé na látky vyvolávající různé typy mutací. Na základě Amesova testu je možné stanovit mutagenní účinek sloučeniny v závislosti na koncentraci S. Typhimurium . Tento test se celosvětově používá pro počáteční screening mutagenního potenciálu nových léčiv. Mutagenní reakce má vysokou prediktivní hodnotu pro karcinogenitu . V průběhu let vědecká komunita a vládní agentury a korporace uznaly hodnotu tohoto testu .

Vzhledem k tomu, že Amesův test je vynikajícím nástrojem pro hodnocení bezpečnosti extraktů, olejů a fytochemikálií izolovaných z léčivých rostlin, použili jsme tento test k hodnocení mutagenního potenciálu oleoresinů nebo extraktů z listů čtyř druhů Copaifera a kyseliny kaurenové.

2. Materiály a metody

2.1. Materiály a metody. Rostlinný materiál

Rostlinný materiál byl sbírán v různých brazilských státech od srpna 2012 do května 2014. Rostlinné vouchery identifikovala buď Dr. Regina Celia Vianna Martins da Silva z botanické laboratoře Brazilské společnosti pro zemědělský výzkum (Embrapa), Belém, stát Pará, Brazílie, nebo Dr. Milton Groppo Junior z katedry biologie Univerzity São Paulo, kampus Ribeirão Preto, stát São Paulo, Brazílie, kde byly vouchery uloženy. V tabulce 1 jsou uvedeny informace o voucherových exemplářích.

K čerpání olejnin C. oblongifolia a C. langsdorffii byl použit vrták k vyvrtání otvoru o průměru přibližně jeden palec. Otvor byl vyvrtán ve středu kmene stromu, tři stopy nad zemí. Oleoresin byl odváděn do jantarové láhve pomocí trubky připojené k filtru. Po shromáždění oleoresinu byl otvor řádně uzavřen .

Listy C. lucens a C. multijuga byly sušeny na vzduchu při 40 °C po dobu 48 hodin nebo lyofilizovány a rozemlety v mixéru. Získaný prášek byl podroben maceraci v ethanolu/vodě 7:3 při pokojové teplotě po dobu 48 h. Po filtraci bylo rozpouštědlo odpařeno pod 40 °C ve vakuu. Tento postup byl čtyřikrát opakován a extrakty byly spojeny, zahuštěny ve vakuu a lyofilizovány, čímž bylo získáno průměrně 20 % hm. surových hydroalkoholových extraktů z listů .

Kyselina kaurenová (obr. 1), čistota nad 99 %, byla izolována podle podrobného popisu Simão et al. Oleoresiny a listy druhu Copaifera byly sbírány a výzkum byl rozvíjen po autorizaci brazilskou vládou prostřednictvím SISBIO (Informační a autorizační systém pro biodiverzitu #35143-1) a CGEN (Rada pro správu genetického dědictví #010225/2014-5).

Obrázek 1

Chemická struktura kyseliny kaurenové.

2.2 Kyselina kaurenová. Amesův test

Amesův test byl použit ke zkoumání mutagenity Copaifera spp. Metodika preinkubace vyvinutá Maronem a Amesem , s exogenní aktivací a bez ní (S9), byla použita k analýze různých kmenů Salmonella Typhimurium (TA98, TA100, TA97a a TA102) ve snaze identifikovat látky způsobující genové mutace. Testované kmeny, laskavě poskytnuté Dr. B. N. Amesem (Berkeley, CA, USA), byly kultivovány ze zmrazených kultur po dobu 12-14 hodin přes noc v Oxoid Nutrient Broth Number 2.

Pro test mutagenní aktivity byly k 0,1 ml bakteriální kultury v 0,5 ml 0,2 M fosfátového pufru nebo 0,5 ml 4% směsi S9 přidány různé koncentrace jednotlivých oleoresinů, jednotlivých extraktů nebo kyseliny kaurenové rozpuštěné v DMSO a inkubovány při 37 °C po dobu 20-30 min. Koncentrace se pohybovaly od 62,5 do 500 μg/desku pro C. lucens (extrakt), od 120 do 1000 μg/desku pro C. multijuga (extrakt), od 125 do 1000 μg/desku pro C. oblongifolia (oleoresin), od 500 do 4000 μg/desku pro C. langsdorffii (oleoresin) a od 25 do 200 μg/desku pro kyselinu kaurenovou. Tyto koncentrace byly zvoleny na základě předběžného testu toxicity. Ve všech následných testech byla horní hranicí testovaného rozmezí dávek buď nejvyšší netoxická dávka, nebo nejnižší toxická dávka stanovená v předběžném testu. Toxicita byla zjištěna buď jako snížení počtu histidinových revertantů (His+), nebo jako ztenčení auxotrofního pozadí trávníku.

Metabolická aktivační směs (frakce S9) připravená z jater potkanů Sprague Dawley ošetřených směsí polychlorovaných bifenylů Aroclor 1254 (500 mg/kg) byla zakoupena od společnosti Molecular Toxicology Inc. (Boone, NC, USA) a čerstvě připravena před každým testem. Metabolický aktivační systém se skládal ze 4 % frakce S9, 1 % chloridu hořečnatého 0,4 M, 1 % chloridu draselného 1,65 M, 0,5 % D-glukosa-6-fosfátu disodného 1 M a 4 % nikotinamidadenindinukleotidfosfátové sodné soli (NADP) 0.1 M v 50 % fosfátového pufru 0,2 M a 39,5 % sterilní destilované vody.

Po inkubaci byly přidány 2 ml vrchního agaru a směs byla nalita na desku obsahující minimální množství agaru. Destičky byly inkubovány při 37 °C po dobu 48 h a kolonie His+ revertantů byly spočítány ručně.

Výsledky byly analyzovány pomocí statistického softwarového balíčku Salanal 1.0 (U.S. Environmental Protection Agency, Monitoring Systems Laboratory, Las Vegas, NV, od Research Triangle Institute, RTP, NC, USA); byl přijat model Bernstein et al. Údaje (revertanty/deska) byly vyhodnoceny analýzou rozptylu (ANOVA) a následně lineární regresí. Pro každou testovanou koncentraci byl také vypočten mutagenní index (MI), který odpovídal průměrnému počtu revertantů na testovací destičku vydělenému průměrným počtem revertantů na kontrolní destičku s rozpouštědlem. Vzorek byl považován za mutagenní, pokud byl zjištěn vztah mezi dávkou a odpovědí a MI byl vyšší než dvě (MI > 2) při jedné nebo více koncentracích .

Následující standardní mutageny byly použity jako pozitivní kontroly v experimentech bez směsi S9: Pro TA98 a TA97a byl použit 4-nitro-O-fenylendiamin (10 μg/deska), pro TA100 azid sodný (1,25 μg/deska) a pro TA102 mitomycin C (0,5 μg/deska). Při pokusech s aktivací S9 byl jako pozitivní kontrola pro TA98, TA97a a TA100 použit 2-antramin (1,25 μg/deska) a jako pozitivní kontrola pro TA102 2-aminofluoren (10 μg/deska). DMSO sloužil jako kontrola rozpouštědla (100 μl/plotnu) a negativní kontrola odpovídá míře spontánní reverze každého kmene.

3. Výsledky

Tabulka 2 uvádí průměrný počet revertantů/plotnu (M), směrodatnou odchylku (SD) a mutagenní index (MI) zjištěný pro S. Typhimurium kmeny TA98, TA100, TA102 a TA97a v přítomnosti (+S9) nebo v nepřítomnosti (-S9) metabolické aktivace po ošetření vzorku cílovým oleoresinem, extraktem nebo sloučeninou.

Na základě Amesova testu nezpůsobily genetické mutace ani extrakty z listů C. lucens a C. multijuga, ani oleoresiny C. langsdorffii a C. oblongifolia. Kyselina kaurenová rovněž nezvýšila počet revertantních kolonií, takže nepůsobila mutagenně v žádné z testovaných koncentrací ani na žádný z hodnocených kmenů. Kontrolní rozpouštědlo (DMSO) se významně nelišilo počtem revertantů od negativní kontroly.

4. Diskuse

Mutagenní účinky působené rostlinami nejsou u člověka snadno pozorovatelné a mohou se projevit nepříznivé dlouhodobé následky, jako je rakovina. Tím vědecká literatura zdůraznila význam screeningu léčivých rostlin na jejich mutagenní účinnost . V tomto smyslu jsme zde zkoumali mutagenní potenciál Copaifera spp. a kyseliny kaurenové pomocí Amesova testu. Akyıl a Konuk zdůraznili, že detekce genotoxických látek často závisí na použití bakterií jako testovacích organismů. Tímto způsobem je Amesův test (nebo Salmonella/mikrosomový test) metodou, která se nejčastěji používá k detekci mutagenních účinků genotoxických látek .

Výkonnost Amesova testu s použitím různých kmenů má velký význam s ohledem na zvláštnosti každého z nich ve vztahu k testu. Takto je marker hisG46 u kmene TA100 výsledkem záměny leucinu (GAG/CTC) za prolin (GGG/CCC). Tato mutace je navrácena do stavu divokého typu mutageny, které způsobují substituční mutace párů bází především na jednom z párů GC. Mutace hisD3052, kterou nese kmen TA98, je mutace s posunem rámce -1, která ovlivňuje čtecí rámec blízké repetitivní sekvence -C-G-C-G-C-G-C-G-G-. Reverze mutace hisD3052 zpět do stavu divokého typu je vyvolána různými mutageny s posunem rámce, jako je 2-nitrofluoren a různé aromatické nitroso deriváty aminokarcinogenů. Mutace hisD6610 v kmeni TA97a také nese mutaci +1 frameshift (cytosin), což vede k běhu 6 cytosinů (-C-C-C-C-C-C-C-). Předpokládá se, že tento kmen je citlivější na některé mutageny, které reverzují kmen TA98. Byl vyvinut kmen TA102, který obsahuje páry bází AT v místě mutace hisG428. Mutace je přenášena na multikopiovém plazmidu pAQ1. Plazmid propůjčuje rezistenci k tetracyklinu, což je vhodný marker pro detekci přítomnosti plazmidu. Mutace hisG428 je okrová mutace, TAA, v genu hisG, kterou lze zvrátit všemi šesti možnými změnami párů bází; jak tranzitem, tak transverzí. Tuto mutaci lze také revertovat mutageny, které způsobují oxidační poškození, kromě toho lze detekovat síťovací činidla .

Biologicky aktivní chemická látka může být navíc biotransformována na neaktivní metabolit. Podobně může být neaktivní chemická látka biotransformována na aktivní metabolit . Proto je důležité používat v Amesově testu frakci S9: umožňuje provádět analýzy za přítomnosti metabolismu, čímž poskytuje spolehlivější výsledky.

Co se týče bezpečnosti, podle našich zjištění kyselina kaurenová ani zkoumané rostliny (extrakty a oleoresiny) nevykazovaly mutagenní účinky u různých kmenů Salmonella Typhimurium bez ohledu na aktivaci S9.

Většina prací o rodu Copaifera uvádí oleoresiny odebrané z kmene stromu. Studium extraktů z listů je však také důležité, protože obsahují slibné bioaktivní molekuly. Hledání léčby nemocí pomocí nálevů z listů totiž mohlo být jedním z prvních způsobů využití přírodních produktů, což je praxe, která se uplatňuje i v dnešní době .

Mnoho druhů Copaifera spp. se v různých zemích s oblibou využívá jako léčivé rostliny, protože tyto druhy vykazují četné farmakologické vlastnosti. Pokud jde o kyselinu kaurenovou, bylo také zaznamenáno několik biologických účinků .

Naše studie je první, která zkoumá bezpečnost druhů C. lucens a C. oblongifolia a také používá C. langsdorffii v oleoresinu pro studium mutagenity. Účinky C. multijuga (oleoresin/extrakt) na DNA se zabývaly předchozí studie, které však používaly odlišné techniky ve srovnání s naší studií, která použila Amesův test. Naše výsledky tak potvrzují údaje publikované jinými autory, kteří testovali jiné druhy Copaifera a jejich chemické složky nebo použili jiné experimentální modely a prokázali, že nepoškozují DNA.

Tímto způsobem se oleoresin z C. multijuga (výtažek, extrakt) stává účinným. multijuga a její chemická značka, diterpenová kyselina kopalová, byly hodnoceny Alvesem a kol. prostřednictvím mikrojaderného testu (buňky V79) a Amesova testu pro studii in vitro, jakož i mikrojaderného a kometového testu (švýcarské myši) pro studii in vivo. Získané údaje ukázaly, že žádný z nich nemá za použitých experimentálních podmínek genotoxický/mutagenní účinek. Při porovnání s našimi výsledky tyto údaje naznačují, že u C. multijuga jak extrakt, který byl hodnocen v naší studii, tak oleoresin, jak jej hodnotili Alves et al. , neovlivňují počet revertantních kolonií ve srovnání s negativní kontrolou v Amesově testu; totéž platí pro kyselinu kopalovou a kyselinu kaurenovou. Tato zjištění naznačují, že mutagenita není přítomna bez ohledu na metabolickou aktivaci.

V nedávné studii Furtado a kol. hodnotili genotoxický potenciál C. multijuga a výsledky prokázaly nepřítomnost poškození DNA, vzhledem k tomu, že ošetření oleoresinem i extraktem z listů C. multijuga významně nezvyšuje frekvenci mikrojader in vitro (buňky V79) a in vivo (švýcarské myši). Kromě toho autoři hodnotili také extrakty a oleoresiny z dalších druhů tohoto rodu, jako jsou C. duckei, C. reticulata, C. paupera a C. pubiflora, a stejně jako u výsledků zjištěných u C. multijuga byla u všech testovaných druhů zaznamenána absence genotoxicity.

Výsledky získané ve studiích Alvese a kol. a Batisty a kol. prokázaly, že extrakt z C. langsdorffii významně nezvyšuje četnost mikrojader (švýcarské myši) v periferní krvi, resp. kostní dřeni. V jiné studii kometový test s použitím potkanů Wistar neodhalil žádné významné rozdíly mezi zvířaty, kterým byl podáván pouze extrakt z C. langsdorffii, a negativní kontrolní skupinou . Tyto údaje ukazují, že extrakt nevykazuje genotoxicitu.

Nejnovější mikrojádrový test in vivo a kometový test s použitím potkanů kmene Wistar ukázaly, že extrakt z Copaifera malmei není genotoxický a má antimutagenní aktivitu. Navíc test subchronické toxicity neodhalil toxikologicky relevantní změny, jak se usuzuje z behaviorálních, biochemických a hematologických analýz po dobu až 30 dnů. Tyto výsledky poukázaly na vysokou míru bezpečnosti extraktu Copaifera malmei pro terapeutické použití . Stanovení toxicity a genotoxicity prokázalo, že použití oleje z kopaiby je rovněž bezpečné: histopatologické hodnocení neodhalilo změny u zvířat ošetřených olejem z kopaiby a hodnocení mutagenity (mikronukleový test; 2000 mg/kg tělesné hmotnosti) neprokázalo genotoxické účinky .

Leandro a kol. použili Amesův test, aby prokázali, že extrakt z C. trapezifolia není mutagenní vůči stejným kmenům Salmonella Typhimurium, které byly testovány zde, nezávisle na metabolické aktivaci.

V souvislosti s chemickým složením různých druhů Copaifera byl při UPLC-MS/MS a CG/MS analýzách oleoresinů identifikován kyselý diterpen a hlavní těkavé seskviterpeny, zatímco v listech byl ověřen vysoký obsah fenolických sloučenin včetně flavonoidních heterosidů a derivátů kyseliny galloylchinové . Mezi složkami oleoresinu jsou zdaleka nejvýznamnější diterpeny, mezi něž patří kyselina ent-agatová, kyselina ent-kopalová a kyselina ent-kaurenová, následované seskviterpeny jako β-bisabolen, α-humulen a trans-β-karyofylen . V případě hydroalkoholových extraktů z listů druhu Copaifera obsahují především kvercetin, afzelin a kyseliny chinové .

Podle Almeidy et al. , oleoresin z kopaiby (komerční produkt) a jeho frakce, které obsahují seskviterpeny, methylestery diterpenových karboxylových kyselin a vysoké množství β-karyofylenu, nejsou genotoxické, jak dokládá kometový test in vivo nebo mikronukleový test. β-karyofylen, hlavní složka oleoresinů a těkavých frakcí, nepodporuje cytotoxické ani genotoxické účinky v kulturách lidských lymfocytů a chrání před poškozením DNA vyvolaným ethylmethansulfonátem . Hodnocení devíti seskviterpenů, včetně transkaryofylenu, pomocí Amesova testu ukázalo, že žádná ze sloučenin není mutagenní .

V nedávné studii ošetření buněčných linií rakoviny žaludku a normální žaludeční sliznice kyselinou kaurenovou ukázalo, že koncentrace kyseliny silně koreluje s indexem poškození DNA a s četností mikrojader, jak bylo stanoveno pomocí kometového testu, resp. mikrojaderného testu . Na druhé straně Cavalcanti et al. uvedli, že nízké koncentrace kyseliny kaurenové, bioaktivního diterpenoidu extrahovaného z C. langsdorffii, nepůsobí poškození DNA ani nemění frekvenci mikrojader v buňkách V79. Výrazně zvýšené poškození DNA se projevilo až po vystavení buněk vyšším koncentracím kyseliny kaurenové (30 nebo 60 μg/ml).

Zde jsme stanovili toxicitu kyseliny kaurenové pro každý hodnocený kmen Salmonella Typhimurium pomocí koncentrací kyseliny od hranice toxicity. Vyšší koncentrace kyseliny kaurenové zabraňují růstu bakterií, což nám umožnilo posoudit mutagenní potenciál této sloučeniny. Na základě našich výsledků zde testované oleoresiny nejsou mutagenní ani při nejvyšších testovaných koncentracích.

Podle literatury může použití různých organismů nebo různých testovacích systémů poskytnout odlišné výsledky . Je tomu tak proto, že zkušební systémy genotoxicity a mutagenity se dělí do dvou skupin. Cytogenetické metody analyzují eukaryota a poskytují informace, které se liší od genových mutací až po poškození chromozomů a aneuploidie. Naproti tomu bakteriální metody analyzují prokaryota a poskytují informace o genové mutaci a primárním poškození DNA způsobeném látkou .

Testy, jako je výměna sesterských chromatid, chromozomální aberace a mikrojádra, byly použity ke zjištění poškození DNA na chromozomální úrovni v lidském biomonitoringu, zatímco Amesův test salmonelové/mikrozomové mutagenity byl široce používán k ověření mutagenní aktivity nesčetných chemických látek a surových rostlinných extraktů .

Podle Fergusona mohou být látky klastogenní v případě savčích buněk, což je případ látek používaných v mikrojaderném testu. Stejné látky však mohou být negativní v bakteriálních testech, jako je Amesův test. Proto je důležité hodnotit bezpečnost rostlin nebo jejich chemických sloučenin se zaměřením na hodnocení různých druhů genetického poškození. Doporučuje se spojení Amesova testu se studiemi na savčích buňkách in vitro, protože mohou pokrýt několik základních mutagenních parametrů (genetické mutace, strukturální poškození chromozomů a aneuploidie) a také pokrýt testy v prokaryotických a eukaryotických systémech. Kromě toho literatura také zdůrazňuje, že studie pomocí Amesova testu by neměla být vynechána, protože bakteriální test genových mutací detekuje všechny relevantní způsoby účinku specificky vedoucí ke genovým mutacím .

Předchozí práce pozorovaly, že sloučeniny mohou být výhradně pozitivní v jedné nebo více savčích buněčných liniích, to znamená, že pozitivní výsledky nebyly podpůrné z Amesova testu nebo testů in vivo . Ve skutečnosti se výsledky získané nejprve Amesovým testem následně opakují v testech na zvířatech ; proto absence mutagenity v Amesově testu umožnila výrobu nových léčiv s menším počtem vedlejších účinků . Tyto údaje zdůrazňují význam studií, jako je ta naše, které prokazují nepřítomnost mutagenity rostlin a jejich hlavních složek pomocí Amesova testu.

5 . Závěry

Celkově naše výsledky podporují bezpečné používání vybraných léčivých rostlin patřících do rodu Copaifera. Nicméně mutagenní účinky jednotlivých sloučenin mohly být maskovány v důsledku antagonistických účinků jiných sloučenin přítomných v extraktech nebo oleoresinech . Naše zjištění tedy také ukazují, že jak kyselinu kaurenovou, tak hodnocené léčivé rostliny lze považovat za potenciálně bezpečné pro terapeutické použití.

Dostupnost údajů

Údaje použité na podporu výsledků této studie jsou součástí článku.

Zveřejnění

Carlos Henrique Gomes Martins, Flávia Aparecida Resende a Jaqueline Lopes Damasceno měli plný přístup ke všem údajům ve studii a přebírají odpovědnost za integritu údajů a přesnost jejich analýzy.

Střety zájmů

Autoři nemají žádné střety zájmů, které by museli zveřejnit.

Příspěvky autorů

Jadira Fernández Arnet, Giovanna Capaldi Fortunato, Luiza Girotto, Gabriel Davi Marena, Beatriz Patti Rocha, Flávia Aparecida Resende, Sergio Ricardo Ambrosio, Rodrigo Cássio Sola Veneziani a Jairo Kenupp Bastos podstatně přispěli ke koncepci a designu, získání, analýze a interpretaci dat. Jaqueline Lopes Damasceno, Flávia Aparecida Resende a Carlos Henrique Gomes Martins se podíleli na přípravě rukopisu nebo na jeho kritické revizi z hlediska důležitého intelektuálního obsahu. Carlos Henrique Gomes Martins a Flávia Aparecida Resende souhlasili s odpovědností za všechny aspekty práce. Všichni autoři si přečetli a schválili konečnou podobu rukopisu.

Poděkování

Autoři děkují CAPES (Koordinace pro zlepšení personálu vysokých škol), CNPq (Národní rada pro vědecký a technologický rozvoj) a Výzkumné nadaci São Paulo (FAPESP, granty č. 2011/13630-7 a 2012/25237-0) za finanční podporu a Univerzitě Franca za získanou podporu. Jaqueline Lopes Damasceno byla příjemkyní doktorandského stipendia CAPES (Coordination for the Improvement of Higher Level-or Education-Personnel).