Využitelnost organických kyselin produkovaných Exiguobacterium sp. 12/1 při neutralizaci alkalických odpadních vod
Abstrakt
Cílem této studie bylo zjistit úlohu organických kyselin produkovaných Exiguobacterium sp. kmenem 12/1 (DSM 21148) při neutralizaci alkalických odpadních vod pocházejících z nápojového průmyslu. O této bakterii je známo, že je schopna růst v médiu o pH až 12,0 a neutralizovat alkalické průmyslové odpadní vody od pH 12,0 do pH 7,5. Tato bakterie je také schopna neutralizovat alkalické průmyslové odpadní vody. Počáteční zkoumání typu funkčních skupin přítomných v médiu, provedené pomocí FT-IR spektroskopie, odhalilo přítomnost píků odpovídajících karbonylové skupině a hydroxylové skupině, což naznačuje uvolňování karboxylové kyseliny nebo souvisejících metabolických produktů. Identifikace specifické karboxylové skupiny provedená pomocí RP-HPLC odhalila přítomnost jediného píku v supernatantu kultury s retenčním časem nejvíce podobným kyselině mravenčí. Koncentrace kyseliny produkované na různých zdrojích uhlíku byla studována v závislosti na čase. Ačkoli byla kyselina přítomna ve stejné konečné koncentraci, míra produkce kyseliny byla nejvyšší v případě média doplněného sacharosou, následovaného fruktosou a glukosou. Poznání metabolických produktů bakterie lze považovat za první krok k realizaci jejího potenciálu pro rozsáhlou bioremediaci alkalických odpadních vod z nápojového průmyslu.
1. Úvod
Alkalify – mikroorganismy, které mají pH optima pro růst při pH 9 nebo vyšším – mají velký vliv na průmyslové aplikace. Biologické detergenty obsahují enzymy, jako jsou alkalické celulázy a/nebo alkalické proteázy, které byly vyrobeny z alkalifilů . Alkalify byly rovněž využity pro průmyslovou výrobu enzymů, které by mohly mít specifické využití, například cyklodextrinu pomocí alkalické cyklomaltodextrin glukanotransferázy a alkalicky aktivní maltohexaosu tvořící α-amylasy, které nacházejí uplatnění v potravinářském, chemickém a farmaceutickém průmyslu. Bylo zjištěno, že alkalicky ošetřená dřevní hmota může být biologicky bělena xylanázami produkovanými alkalifily . Fujiwara a spolupracovníci informovali o použití alkalické proteázy k rozkladu želatinového povlaku rentgenových filmů, z nichž bylo získáno stříbro. Alkalifily také prokázaly svůj potenciál při biodegradaci různých organických sloučenin .
Akalifilní bakterie vzbudily velký zájem díky svým extracelulárním enzymům a biochemickým vlastnostem, jako je alkalifilita a alkalická stabilita. Jejich bioenergetika byla také poměrně podrobně zkoumána , zatímco o jejich fyziologii, například o intracelulárních enzymech a metabolitech, je známo jen málo. Vlastnosti mezibuněčného metabolického procesu jsou důležité, protože pomáhají charakterizovat bakterii, její enzymové složení, metabolický stupeň buněk a možnosti metabolického inženýrství. Schopnost alkalifilů silně měnit pH média obsahujícího sacharidy byla využita v předchozí práci pro neutralizaci vysoce alkalických odpadních vod pocházejících z nápojového průmyslu pomocí Exiguobacterium sp. kmene 12/1 . Rod Exiguobacterium patří do řádu Bacillales, který zahrnuje také příslušníky rodu Bacillus. Exiguobacterium sp. 12/1 je fakultativní alkalofil, který optimálně roste při pH 10 a je schopen neutralizovat alkalické odpadní vody a snížit je z pH 12,0 na pH 7,5. Předpokládá se, že bakterie uvolňuje nějaký kyselý metabolický produkt (produkty), aby neutralizovala vysoce alkalické vnější prostředí. Je však důležité charakterizovat typ metabolitů uvolňovaných do extracelulárního prostředí. Zde studujeme produkci organických kyselin jako možný mechanismus neutralizace alkálií. Takové typy studií budou nezbytné předtím, než bude možné vyvinout rozsáhlé aplikace bakterie pro neutralizaci alkalických odpadních vod z nápojového průmyslu.
Hlavním zdrojem uhlíku v odpadních vodách z nealkoholického průmyslu je sacharóza (disacharid obsahující glukózu a fruktózu), která se také nejvíce podílí na její biochemické spotřebě kyslíku (BSK) . Průměrná BSK odpadních vod z výroby nealkoholických nápojů se pohybuje od 600 do 4500 mg/l, což odpovídá 673-5052 ppm sacharózy. Literární průzkum metabolických produktů velkého počtu bakterií rostoucích na jednoduchých cukrech naznačuje, že bakterie by mohly tyto jednoduché cukry využívat k tvorbě organických kyselin. To potvrzuje i analýza extracelulárních metabolických produktů jiných alkalifilních druhů Bacillus . Bylo zjištěno, že hlavní organickou kyselinou produkovanou na sacharosovém zdroji uhlíku v těchto studiích je kyselina octová. Kyselina mravenčí je běžným metabolitem neutrofilních bakterií v anaerobních podmínkách, zatímco B. circulans var. alkalophilus jí produkuje až 2 g/l i v aerobních kulturách. Další těkavé kyseliny, jako je kyselina propionová, máselná, isomáselná a isovalerová, jsou typické pro kmeny Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus a Bacillus sp. 17-1. Kyseliny isomáselná a isovalerová byly zaznamenány v médiích několika neutrofilních bacilů . Tyto kyseliny, stejně jako kyseliny propionová a máselná, jsou však považovány za pocházející z aminokyselin na základě studií na Clostridium sp. . Kyseliny mléčná a pyrohroznová jsou poměrně běžně produkovány neutrofilními bacily , ale produkce kyseliny jantarové bakteriemi Bacillus je vzácná . Etanol nebyl u alkalických bacilů zjištěn, přestože je typickým produktem glukózových kultur mnoha neutrofilních bacilů . Alkalické růstové podmínky tedy mohou ovlivňovat produkci neutrálních metabolitů . V této studii jsme použili vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii na reverzní fázi ke studiu typu a koncentrace kyselin produkovaných Exiguobacterium sp. kmenem 12/1 během neutralizace média o vysokém pH obsahujícího různé typy zdrojů uhlíku.
2. Materiál a metody
2.1. Materiál a metody. Kmen a kultivační podmínky
Kultura Exiguobacterium sp. 12/1 byla získána od firmy DSMZ (DSM 21148) a byla udržována ve formě glycerolových zásob. Pro běžnou kultivaci kmene 12/1 při 37 °C bylo použito alkalické základní médium (ABM) obsahující (všechny koncentrace v g/l): pepton, 1; kvasničný extrakt, 0,5; glukóza, 1; K2HPO4, 0,1; Na2CO3, 1; pH 10 (poslední tři složky byly přidány do autoklávovaného média ze samostatně sterilizovaných roztoků). Pro IR a RP-HPLC analýzu byla bakterie kultivována při 37 °C, 200 otáčkách za minutu v minimálním solném médiu (MSM) obsahujícím (všechny koncentrace v mM): K2HPO4, 10; KH2PO4, 10; MgSO4-7H2O, 1; disodná sůl EDTA, 0,3; ZnSO4-7H2O, 0,01; MnSO4, 0,02; CuSO4-5H2O, 0,004; FeSO4-7H2O, 0,1; NaMoO4-2H2O, 0.004; (NH4)2SO4, 5 a 1 % (w/v) jednoho z následujících sacharidů: glukosy, fruktosy nebo sacharosy (všechny složky se přidávají ze samostatně autoklávovaných koncentrovaných zásobních roztoků). Konečné pH média bylo upraveno na 10,5 pomocí 1 N NaOH.
2,2. Analýza růstu a pH kultury
1 ml kultury v logaritmické fázi na ABM byl použit k inokulaci prekultivací (50 ml) (MSM obsahující 1 % cukru). Vlastní testovací kultura (250 ml MSM v 500 ml Erlenmeyerově baňce) byla naočkována celou prekulturou ve střední log. fázi (O.D. ~ 1,2). Každá sada kultur se skládala ze tří baněk. Jako míra bakteriálního růstu byla použita absorbance vzorků při vlnové délce 650 nm. pH bylo stanoveno ve vzorcích bezbuněčných kultur při pokojové teplotě po odstředění 4000 ×g po dobu 20 min.
2.3. FT-IR analýza
Kultura byla odebrána po 60 h růstu a byla odstředěna při 4000 ×g po dobu 20 min. Pro IR analýzu byl supernatant kultury vysušen mrazem a rozdrcen na prášek. Práškový supernatant byl poté smíchán s bromidem draselným a směs byla slisována do tablety. Nakonec byla tableta analyzována pomocí spektrometru FT/IR-4200 (JASCO, Tokio, Japonsko). Analýza RP-HPLC
Kultura byla odebrána v různých časových bodech a byla odstředěna při 4000 ×g po dobu 20 minut. Pro HPLC analýzu byl supernatant kultury přefiltrován přes 0,22 μm filtr a 10 μl přefiltrovaného vzorku bylo vstříknuto do HPLC kolony.
Analytická standardní kyselina mravenčí, kyselina octová, kyselina jantarová, kyselina propionová, kyselina mléčná a kyselina isomáselná byly získány od společnosti Sigma. Byly připraveny zásobní standardní roztoky (100 mg/ml nebo 100 μl/ml), které byly uchovávány při 4 °C pro další použití. Pracovní standardní roztoky (10 mg/ml nebo 10 μl/ml) byly připravovány denně. K přípravě pufrů a zásobních roztoků jednotlivých sloučenin a vzorků byla použita voda Milli-Q (Millipore). Zásobní roztoky, vzorky a pufr byly filtrovány přes celulózové membránové filtry Whatman (0,45 μm, Whatman, Clifton, NJ, USA). Rozpouštědla byla před použitím odplyněna ve vakuu.
Analýza organických kyselin byla provedena podle metody Torma a Izca. Analýza byla provedena na systému Breeze (Waters, Mildford, MA, USA) sestávajícím z binární HPLC pumpy 1525, autosampleru 717 plus a dvoukanálového UV detektoru 2487 nastaveného na 210 nm, ovládaného pomocí softwaru Breeze. Separace byla provedena na koloně Atlantis dC18 (Waters) 250 × 4,6 × 5 μm. Denně se připravovalo 20 mM NaH2PO4 upraveného kyselinou fosforečnou na pH 2,20 a filtrovalo se přes hydrofilní membrány 0,2 μm (Millipore). Program rozpouštědel využíval dva zásobníky obsahující 1 % acetonitrilu ve 20 mM fosfátovém pufru upraveném na pH 2,20 s kyselinou fosforečnou (rozpouštědlo A) a acetonitril (rozpouštědlo B); průtok byl nastaven na 1,5 ml/min při pokojové teplotě. Gradientní program začínal se 100 % rozpouštědla A a po 7 min se lineárně zvyšoval obsah rozpouštědla B, aby se za 5 min dosáhlo 7 %. Od 12 do 19 min byla rychlost udržována na 93 % rozpouštědla A a 7 % rozpouštědla B. Poté byla rychlost změněna na výchozí podmínky, aby se kolona vyrovnala po dobu 15 min před opětovným nástřikem 10 μl dalšího vzorku.
3. Výsledky
3.1. Zpracování vzorků Analýza neutralizace na definovaném médiu
Pro analýzu organických kyselin produkovaných bakterií bylo vybráno médium s minimem soli, protože má definovaný charakter a podobný zdroj uhlíku jako odpadní vody z nápojového průmyslu. Bakterie mohla růst v minimálním solném médiu doplněném různými zdroji uhlíku – glukosou, fruktosou a sacharosou. Obrázek 1 ukazuje růstový profil a charakteristiky pH média v čase. Fruktóza a sacharóza vedly k mnohem rychlejší neutralizaci média ve srovnání s glukózou. Konečné pH získané s glukózou bylo také o něco vyšší než pH získané v případě média doplněného sacharózou a fruktózou. To se také odrazilo v růstovém profilu bakterie pěstované na těchto třech zdrojích uhlíku. Bakterie rostly rychleji na sacharose následované fruktosou a glukosou.
(a)
(b)
(a)
(b)
Změna pH (a) a O.D. (b) v závislosti na čase na MSM. Hodnoty představují průměr ze tří opakovaných měření a chybové úsečky představují směrodatnou odchylku.
3.2. Identifikace funkční skupiny přítomné v supernatantu kultury
Pro identifikaci široké funkční skupiny metabolitu produkovaného bakterií za účelem neutralizace alkalické odpadní vody byl lyofilizovaný supernatant kultury podroben FT-IR spektroskopii. Ve spektru byly přítomny dva píky odpovídající karbonylové skupině (při 1644,98 cm-1) a hydroxylové skupině (při 3436,74 cm-1) (tab. 1). Podle literárního průzkumu bakterie s největší pravděpodobností produkuje organické kyseliny jako metabolický produkt, který neutralizuje alkalickou odpadní vodu.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.3. Kultivace kmene 12/1. Identifikace specifického metabolického produktu bakterie
Za účelem identifikace organické kyseliny produkované bakterií byla provedena HPLC na reverzní fázi s použitím známých standardů organických kyselin vybraných po průzkumu literatury. Standardy byly provedeny jak jednotlivě (obrázek 2(a)), tak ve směsi (obrázek 2(b)), aby se zjistily případné rozdíly v retenčním čase vzniklé v důsledku interference jinými organickými kyselinami v médiu. Bylo zjištěno, že RT standardních organických kyselin je v obou případech podobný a rozdíl v retenčním čase nepřesahuje 0,09 jednotky s výjimkou kyseliny propionové (tabulka 2). Supernatant kultury byl analyzován stejnou metodou a bylo zjištěno, že obsahuje jediný pík s retenčním časem podobným kyselině mravenčí. To bylo dále potvrzeno špikováním supernatantu standardní kyselinou mravenčí, jejíž pík se superponoval s píkem produktu v supernatantu (obrázek 2 d)).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
RP-HPLC chromatogramy jednotlivých standardních organických kyselin (a), standardních organických kyselin ve směsi (b), supernatantu kultury (c) a supernatantu kultury obohaceného kyselinou mravenčí.
3.4. Kvantitativní analýza metabolického produktu bakterie
Pro kvantitativní analýzu kultivačního supernatantu byly provedeny různé standardní koncentrace kyseliny mravenčí a byla vypočtena plocha píku odpovídající každé koncentraci. Plocha píku byla vynesena do grafu v závislosti na koncentraci, aby se získala standardní křivka (obrázek 3). Tato standardní křivka byla použita k výpočtu množství kyseliny produkované s časem na minimálním solném médiu doplněném různými zdroji uhlíku. Supernatant kultury bakterie byl analyzován v závislosti na čase a opět byl podroben analýze HPLC s reverzní fází. Bylo zjištěno, že pík hlavního produktu v supernatantu bakteriální kultury se s časem zvyšuje. Retenční čas kyseliny je podobný retenčnímu času kyseliny mravenčí. Studium kyseliny mravenčí produkované s různými zdroji uhlíku v závislosti na čase je znázorněno na obrázku 4. Nejvyšší množství kyseliny bylo vyprodukováno v případě MSM doplněné sacharózou, následované fruktózou a glukózou.
Standardní křivka pro stanovení koncentrace kyseliny mravenčí v supernatantu kultury.
Změna množství produkované organické kyseliny v čase na MSM doplněné různými zdroji uhlíku. Hodnoty představují průměr ze tří opakovaných měření a chybové úsečky představují směrodatnou odchylku.
4. Diskuse
Hlavním zdrojem uhlíku v odpadní vodě z nápojového průmyslu je sacharóza . Proto bylo pro analýzu metabolického produktu vznikajícího při neutralizaci zvoleno dobře definované prostředí s minimálním obsahem soli obsahující sacharosu a dva složkové monosacharidové cukry – glukosu a fruktosu. Růstové charakteristiky kmene 12/1 na minimálním solném médiu doplněném třemi zdroji uhlíku ukazují účinnou neutralizaci současně s růstem (obrázky 1 a) a 1 b)). Snížení pH růstového média je nutně způsobeno buď tvorbou kyselin, nebo odstraněním zásad .
Tvorba kyselin je dobře zdokumentována v případě bakterií pěstovaných na jednoduchých cukrech. Byly studovány metabolické produkty některých alkalifilních zástupců rodu Bacillus . V těchto studiích bylo zjištěno, že hlavní organickou kyselinou produkovanou na zdroji uhlíku sacharózy je kyselina octová. Sekvence genomu alkalifilních druhů bacilů – Bacillus pseudofirmus OF4, Bacillus halodurans a Bacillus clausii – toto pozorování rovněž podporují, neboť všechny tyto druhy mají funkční dráhu přeměny pyruvátu na acetát. Kyselina mravenčí je běžným metabolitem neutrofilních bakterií v anaerobních podmínkách, zatímco B. circulans var. alkalophilus jí produkuje až 2 g/l i v aerobních kulturách. Další těkavé kyseliny, jako je kyselina propionová, máselná, isomáselná a isovalerová, jsou typické pro kmeny Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus a Bacillus sp. 17-1. Kyseliny isomáselná a isovalerová byly zaznamenány v médiích několika neutrofilních bacilů . Tyto kyseliny, stejně jako kyseliny propionová a máselná, jsou však považovány za pocházející z aminokyselin na základě studií na Clostridium sp. . Kyseliny mléčná a pyrohroznová jsou poměrně běžně produkovány neutrofilními bacily , ale produkce kyseliny jantarové bakteriemi Bacillus je vzácná . Etanol nebyl u alkalických bacilů zjištěn, přestože je typickým produktem glukózových kultur mnoha neutrofilních bacilů . Alkalické podmínky růstu tedy mohou ovlivňovat produkci neutrálních metabolitů .
Počáteční studie metabolických produktů u bacillus sp. byly provedeny pomocí titračního postupu . Zvýšená pufrovací kapacita supernatantu bakteriální kultury kolem pH 5, což je typický rozsah protonizace karboxylových kyselin, byla použita k hypotéze, že médium obsahuje karboxylové kyseliny. V této studii jsme použili FT-IR spektroskopii ke zjištění funkční skupiny sloučeniny (sloučenin) přítomné v supernatantu kultury. FT-IR spektrograf ukázal píky charakteristické pro karbonylovou skupinu (při 1644,98 nm) a hydroxylovou skupinu (při 3436,74 nm) (tabulka 1), což naznačuje přítomnost chemického druhu sestávajícího z hydroxylové a karbonylové skupiny a s největší pravděpodobností se jedná o karboxylové kyseliny.
K analýze organických kyselin přítomných v kultivačním supernatantu byla použita metoda HPLC s reverzní fází . Podmínky HPLC byly zvoleny pro nejlépe popsané rozlišení, tj. pH 2,2 a 1% acetonitril. Metoda HPLC s reverzní fází je výhodná z důvodu použití levnějších kolon, snadnější manipulace s analytickými parametry pro optimalizaci separace a analýz při pokojové teplotě . Metoda byla nejprve použita k výpočtu retenčního času standardů kyselin vybraných podle literárního průzkumu. Pořadí eluce kyselin za těchto podmínek bylo stejné jako pořadí uvedené v Tormovi a Izcovi , ale v retenčních časech pozorovaných v této studii a v časech uvedených v Tormovi a Izcovi byly rozdíly. Tato odchylka může být způsobena rozdílem v podmínkách HPLC, jako je teplota 25-30 °C v této studii oproti 24 °C ± 1 °C uváděných v Tormo a Iczo .
RP-HPLC supernatantu kultury vykazuje přítomnost jediného píku s absorbancí při vlnové délce 211 nm, což je charakteristická absorpční vlnová délka organických kyselin. Supernatant tedy obsahuje jediný chemický druh, kterým je s největší pravděpodobností organická kyselina. Srovnání retenčního času tohoto píku a retenčního času standardních organických kyselin ukazuje, že retenční čas je nejvíce podobný kyselině mravenčí. Toto pozorování bylo dále potvrzeno přidáním kyseliny mravenčí do supernatantu kultury, což zvýšilo plochu píku produktu (obrázky 2c) a 2d)). Přítomnost kyseliny mravenčí v supernatantu kultury je v souladu s metabolickými produkty některých alkalických zástupců rodu Bacillus a také některých sacharolytických anaerobních alkalických bakterií, jako jsou Halonatronum saccharophilum, Amphibacillus fermentum a Amphibacillus tropicus .
Maximální pokles jednotek pH vyskytující se za jednotku času, který byl dosud zaznamenán u alkalických bakterií, je 0,13 jednotek za hodinu v případě Bacillus circulans var. alkalophilus, což je poměrně málo ve srovnání s více než dvoujednotkovým poklesem během počáteční 1 h inokulace zaznamenaným v této studii. Velký pokles pH naznačuje tvorbu kyselých produktů katabolismu. Samotná rychlost poklesu pH však neznamená zvýšení koncentrace kyselin . Proto byla provedena kvantitativní analýza metabolických produktů bakterie pomocí RP-HPLC. HPLC byla dána přednost před GC, protože ze srovnání metod GC a HPLC pro stanovení organických kyselin v kultivačních supernatantech alkalofilních bakterií vyplývá, že zatímco rozlišení kyselin pomocí GLC bylo vynikající, kvantitativní reprodukovatelnost pomocí HPLC byla lepší než u GLC . Podle očekávání bylo zjištěno, že koncentrace produkovaných kyselin se zvyšuje s prodlužující se dobou inkubace (obr. 4). Ve skutečnosti se množství kyseliny zvyšovalo i po dosažení minimálního pH. To je v souladu s dřívějšími studiemi produkce kyseliny u fakultativních a obligátních alkalických Bacillus sp., kde produkce kyseliny pokračovala ve zvyšování i 30 h po dosažení minimálního pH . Srovnávací analýza metabolického produktu produkovaného v médiích doplněných různými zdroji uhlíku ukazuje, že ačkoli byla kyselina přítomna ve stejné konečné koncentraci, míra produkce kyseliny byla nejvyšší v případě média doplněného sacharosou, následovaného fruktosou a glukosou (obr. 4). To je v souladu s růstovými charakteristikami organismu v médiích doplněných těmito cukry.
5. Závěr
Exiguobacterium sp. kmen 12/1 neutralizuje pH vnějšího média produkcí organické kyseliny s krátkým řetězcem – kyseliny mravenčí. S ohledem na potenciální využití bioremediace alkalických odpadních vod ve velkém měřítku lze tuto schopnost bakterie neutralizovat alkálie u odpadních vod z nápojového průmyslu považovat za první krok k využití jejího komerčního potenciálu.
Poděkování
N. M. Kulshreshtha děkuje University Grants Commission za výzkumné stipendium. Autoři jsou nesmírně vděční Radě pro vědecký a průmyslový výzkum, Indie, za poskytnutí výzkumné& platformy a zařízení pro tento výzkum.