Interakce rentgenového záření s elektrony v krystalu vede ke vzniku difrakčního obrazce, který je matematicky Fourierovou transformací rozložení elektronové hustoty. Detektory používané k měření rentgenového záření však mohou měřit pouze amplitudu difraktovaného rentgenového záření; fázové posuny, které jsou nutné k použití Fourierovy transformace a nalezení rozložení elektronové hustoty, nejsou touto metodou přímo měřitelné. To je ve fyzikální komunitě známo jako „fázový problém“. Zjednodušeně řečeno, fáze nelze zjistit z naměřených amplitud rentgenového záření. Je třeba provést další extrapolace a další experimenty, aby bylo možné získat mapu elektronové hustoty. Mnohdy mohou pomoci stávající údaje o fyzikálních a chemických vlastnostech sloučeniny, pokud je mapa hustoty špatná. Další metoda známá jako Pattersonova syntéza je velmi užitečná pro zjištění počátečního odhadu fází a je velmi užitečná pro počáteční fáze určování struktury proteinů, když fáze nejsou známy. Problém lze zjednodušit nalezením atomu, obvykle těžkého kovu, pomocí Pattersonovy syntézy a následným využitím polohy tohoto atomu k odhadu počátečních fází a výpočtu počáteční mapy elektronové hustoty, která může dále pomoci při modelování polohy ostatních atomů a ještě více zlepšit odhad fází. Další metoda se nazývá Molecular Replacement; lokalizuje umístění struktury proteinu v buňce. Kromě metody molekulární náhrady lze fázový problém řešit také metodou izomorfní náhrady, metodou anomální difrakce s více vlnovými délkami, metodou anomální difrakce s jednou vlnovou délkou a přímými metodami.

Molekulární náhradaUpravit

Fázový problém lze vyřešit, pokud máme atomový model, který dokáže vypočítat fáze. Model lze získat, pokud je známa struktura souvisejícího proteinu. Aby však bylo možné tento atomární model sestavit, je třeba určit orientaci a polohu modelu v nové jednotkové buňce. Tehdy přichází na řadu technika, molekulární náhrada (nebo MR).

Molekulární náhrada, známá také jako MR, je metoda řešení fázových problémů v rentgenové krystalografii. MR lokalizuje orientaci a polohu proteinové struktury s její jednotkovou buňkou, jejíž proteinová struktura je homologická s neznámou proteinovou strukturou, kterou je třeba určit. Získané fáze mohou pomoci vytvořit mapy elektronové hustoty a pomoci vytvořit vypočtené intenzity polohy modelu proteinové struktury k pozorovaným strukturám z rentgenového krystalografického experimentu.

Metoda MR je také účinná při řešení makromolekulárních krystalových struktur. Tato metoda vyžaduje méně času a úsilí pro určení struktury, protože není třeba připravovat deriváty těžkých atomů a sbírat data. Metoda je přímočará a sestavení modelu je zjednodušeno, protože nepotřebuje sledování řetězců.

Tato metoda se skládá ze dvou kroků:

1. rotační hledání pro orientaci homologního modelu v jednotkové buňce nebo cíl
2. translační cíl, kde je nově orientovaný model umístěn v jednotkové buňce

Patterson-based (Molecular Replacement)Edit

Pattersonovy mapy jsou meziatomové vektorové mapy, které obsahují vrcholy pro každý příbuzný atom v jednotkové buňce. Pokud byly Pattersonovy mapy vytvořeny na základě údajů odvozených z map elektronové hustoty, měly by být obě Pattersonovy mapy navzájem úzce příbuzné pouze v případě, že je model správně orientován a umístěn ve správné poloze. To nám umožní odvodit informace o umístění neznámé struktury proteinu s jeho buňkou. U molekulární náhrady je však problém, má šest rozměrů, tři parametry pro určení orientace a polohy. Pomocí Pattersonových map ji lze rozdělit na podmnožiny parametrů a podívat se tak na každou část zvlášť.

Rotační funkcePravit

Rotační funkce má intramolekulární vektory, které závisí pouze na orientaci molekuly, nikoli na její poloze, protože i když je molekula přeložena v jednotkové buňce, všechny atomy jsou posunuty o stejnou hodnotu, ale vektory mezi atomy jsou stejné. Pattersonova mapa pro neznámou strukturu proteinu je porovnána s homologní strukturou známého proteinu v různých orientacích

Klasická rotační funkceEdit

Pro zjištění orientace určete osu otáčení a úhel otáčení kolem této osy. K určení osy (vektoru ze středu koule do bodu na povrchu koule) budou potřeba dva parametry. Osa otáčení začíná rovnoběžně s osou z a otáčí se kolem osy y o úhel ᶱ, pak se objekt otáčí kolem osy z o úhel ᶲ a nakonec se otáčí kolem osy otáčení o úhel ᵠ. Ty určují bod na povrchu jednotkové koule.

Rychlá rotační funkceEdit

Rotační funkci lze vypočítat porovnáním dvou Pattersonových map nebo vrcholů v těchto Pattersonech. Rotační funkci lze pomocí Fourierovy transformace vypočítat mnohem rychleji pouze v případě, že by Pattersony byly vyjádřeny ve sférických harmonických.

Přímá rotační funkceEdit

Při přímé rotační funkci lze proteinovou strukturu umístit do jednotkové buňky neznámé struktury a Patterson pro orientovanou molekulu se porovná s Pattersonem celé neznámé struktury.

Translační funkceEdit

Jakmile je známa orientace známé struktury, lze její model (mapu elektronové hustoty) orientovat pro výpočet strukturních faktorů, kde se korelační funkce použije k určení vektoru pro translaci modelu na homologní model v rámci asymetrické jednotky.

Při správné orientaci a translaci fázových modelů proteinové struktury je dostatečně přesné odvodit mapy elektronové hustoty z odvozených fází. Mapy elektronové hustoty lze použít k sestavení a zpřesnění modelu neznámé struktury.

Anomální difrakce s více vlnovými délkamiRedakce

Rentgenové záření se generuje ve velkých zařízeních zvaných synchrotrony. Synchotrony urychlují elektrony téměř na rychlost světla a pohybují se s nimi ve velkém dutém kovovém mnohoúhelníkovém prstenci. V každém rohu magnety ohýbají proud elektronů, což způsobuje emisi energie ve formě elektromagnetického záření. Protože se elektrony pohybují rychlostí světla, vyzařují vysokoenergetické rentgenové záření.

Výhodou použití synchrotronů je, že výzkumníci nemusí pěstovat několik verzí každé krystalizované molekuly, ale místo toho pěstují pouze jeden typ krystalu, který obsahuje selen. Mají pak možnost vyladit vlnovou délku tak, aby odpovídala chemickým vlastnostem selenu. Tato technika je známá jako anomální difrakce s více vlnovými délkami. Krystaly jsou pak několikrát bombardovány vlnovými délkami různých délek a nakonec vznikne difrakční obrazec, který vědcům umožní určit polohu atomů selenu. Tuto polohu lze použít jako referenci nebo značku pro určení zbytku struktury. Výhody této metody umožňují výzkumníkům shromáždit data mnohem rychleji.

Metoda izomorfní záměnyUpravit

Tato metoda porovnává rentgenové difrakční obrazce mezi původním krystalem bílkoviny a krystalem stejného typu s přidáním alespoň jednoho atomu s vysokým atomovým číslem. Metodu použil k určení struktury malých molekul a nakonec i hemoglobinu Max Ferdinand Perutz (1914-2002). Dokonalý izomorfismus nastává, když původní krystal a jeho derivát mají přesně stejnou konformaci bílkoviny, polohu a orientaci nebo molekuly a parametry jednotkové buňky. Jediný rozdíl, který má krystal a jeho derivát v dokonalém izomorfismu, jsou rozdíly v intenzitě způsobené přidáním těžkých atomů na derivátu. Tyto rozdíly lze identifikovat ručně nebo pomocí automatického Pattersonova vyhledávacího postupu, například SIR 2002, SHELXD, nB a ACORN, a tyto informace jsou důležité pro určení fázových úhlů proteinu. Dokonalý izomorfismus však stěží nastane kvůli změně rozměrů buněk. Pro protein s těžkým atomem je jeho tolerovatelná změna rozměru buňky dmin/4, neboť dmin je mez rozlišení. K neizomorfismu přispívají i další faktory, například rotace.

PostupyUpravit

1. Připravte několik derivátů proteinu v krystalické struktuře. Poté změřte rozměr buňky a zkontrolujte izomorfismus.
2. Shromážděte údaje o intenzitě rentgenového záření původního proteinu a jeho derivátu.
3. Použijte Pattersonovu funkci k určení souřadnic těžkého atomu.
4. Zpřesněte parametry těžkého atomu a vypočítejte fázový úhel proteinu.
5. Vypočítejte elektronovou hustotu proteinu.

Deriváty jsou vytvořeny pomocí dvou různých metod. Upřednostňovanou metodou je namáčení bílkovinného krystalu v roztoku, který je složen identicky jako matečný roztok, ale s mírně zvýšenou koncentrací srážedla. Další metodou je ko-krystalizace, která se však běžně nepoužívá, protože krystal neroste nebo roste neizomorfně. Postup namáčení závisí na tom, jak široké jsou póry krystalu. Póry by měly být dostatečně široké, aby činidlo mohlo difundovat do krystalu a dosáhnout reaktivních míst na povrchu všech molekul bílkovin v krystalu.

Metoda vícenásobné vlnové délky anomální difrakceRozšířit

Vícená vlnová délka anomální difrakce (zkráceně MAD) je metoda využívaná v rentgenové krystalografii, která nám umožňuje určit struktury biologických makromolekul, jako jsou bílkoviny a DNA, za účelem řešení fázového problému. Požadavky na strukturu zahrnují atomy, které způsobují významný rozptyl rentgenového záření; zejména síru nebo kovové ionty z metaloproteinů. Protože selen může nahradit přírodní síru, používá se častěji. Použití této techniky značně usnadňuje krystalografovi použití metody vícenásobné izomorfní náhrady (MIR), protože příprava těžkých sloučenin je zbytečná.

Tato metoda se používá k řešení fázových problémů, když kromě amplitud nejsou k dispozici údaje týkající se rozptylu difrakce. Navíc se používá, když je atom těžkého kovu již vázán uvnitř proteinu nebo když krystaly proteinu nejsou izomorfní, což je pro metodu MIR nevhodné. Metoda se většinou používá pro roztoky těžkých kovů, tyto kovové enzymy obvykle pocházejí z 1. přechodové řady a jejich sousedů. pro provedení tohoto experimentu je důležité mít zdroj silného magnetického pole, v úvahu je třeba vzít i prostředí, jako je podzemí. Pro tuto metodu je také zapotřebí urychlovač částic zvaný synchrotron.

Metoda anomální difrakce s jednou vlnovou délkouEdit

V porovnání s anomální difrakcí s více vlnovými délkami (MAD) využívá anomální difrakce s jednou vlnovou délkou (SAD) jediný soubor dat z jedné vlnové délky. Hlavní výhodný rozdíl mezi MAD a SAD spočívá v tom, že při SAD stráví krystal v rentgenovém svazku méně času, což snižuje potenciální radiační poškození molekuly. Protože SAD používá pouze jednu vlnovou délku, je také časově úspornější než MAD.

Mapy elektronové hustoty odvozené z dat anomální difrakce s jednou vlnovou délkou musí projít úpravami, aby se vyřešily fázové nejasnosti. Běžnou technikou modifikace je zploštění rozpouštědla a při kombinaci SAD se zploštěním rozpouštědla jsou výsledné mapy elektronové hustoty srovnatelné kvality s mapami odvozenými z úplného fázování MAD. Zploštění rozpouštědla zahrnuje úpravu elektronové hustoty intersticiálních oblastí mezi molekulami bílkovin obsazených rozpouštědlem. Předpokládá se, že oblast rozpouštědla je ve srovnání s proteinem relativně neuspořádaná a bezpříznaková. Vyhlazení elektronové hustoty v oblastech rozpouštědla zvýší elektronovou hustotu proteinu na interpretovatelnou úroveň. Tato metoda se nazývá ISAS, iterativní anomální rozptyl s jednou vlnovou délkou.

Přímé metodyUpravit

Přímá metoda může pomoci obnovit fáze pomocí získaných dat. Přímá metoda odhaduje počáteční a expandující fáze pomocí trojného vztahu. Trojný (trojný) vztah je vztah intenzity a fáze jednoho odrazu se dvěma dalšími intenzitami a fázemi. Při použití této metody záleží na velikosti proteinové struktury, protože rozdělení pravděpodobnosti fáze je nepřímo úměrné druhé odmocnině z počtu atomů. Přímá metoda je nejužitečnější technikou pro řešení fázových problémů.