γδ-selekce

γδT buňky vznikají z DN thymocytů, protože ve stádiu DN dochází k přeskupení řetězců TCRγ a δ . Prekurzorové buňky γδ, které mají TCRγ a δ přeskupené před rekombinací TCRβ, exprimují komplex γδTCR/CD3 na plazmatické membráně, kde se γδTCR samooligomerizuje jako pre-TCR a iniciuje intracelulární signální dráhy . Tento signál γδTCR vyvolává proces označovaný jako „γδ-selekce“, který potvrzuje vznik funkčních řetězců TCRγδ, čímž buňka rozpozná, že „jsem buňka γδT“ .

Signál γδ-selekce spouští diferenciaci z prekurzorových buněk γδ s vysokým obsahem CD5- CD24 na buňky γδT s nízkým obsahem CD5+ CD24 . Přechod z CD5- na CD5+ γδT buňky je u myší s deficitem Syk výrazně narušen, zatímco myši s deficitem Zap70 vykazují normální diferenciaci CD5+ γδT buněk. Zap70/Syk dvojnásobně deficientní myši vykazují úplné zastavení diferenciace γδT buněk ve stadiu CD5- prekurzorů . Selekce γδ je tedy závislá především na signálu zprostředkovaném Sykem a Zap70 hraje v tomto procesu pouze menší a nadbytečnou roli. Tento mechanismus je zcela analogický mechanismu β-selekce. Jedním z kritických cílů Syk v signálu γδ-selekce je signalizátor Lat, protože Lat-deficientní myši vykazují úplnou inhibici γδ-selekce a naprostý nedostatek zralých γδT buněk .

γδ prekurzorové buňky ze Syk/Zap70-deficientních myší nebo Lat-deficientních myší jsou expresí svých povrchových proteinů s výjimkou γδTCR neodlišitelné od buněk linie αβT a stále si zachovávají potenciál diferencovat se v buňky αβT . Co určuje osud diferenciace do linie αβT nebo γδT z prekurzoru? Touto otázkou se zabývaly studie využívající transgenní myši s γδTCR. Když je signál γδTCR oslaben nedostatkem buď signálních proteinů, nebo endogenních ligandů pro transgenní γδTCR, prekurzorové buňky daly vzniknout buňkám linie αβT DP na úkor buněk linie γδT . Tyto výsledky naznačují, že silnější signál (pravděpodobně při interakci γδTCR s ligandem) vede k závazku k buňkám γδT, zatímco slabší signál (pravděpodobně prostřednictvím pre-TCR nezávislého na ligandu) vede k diferenciaci αβT. Pokusy s jiným transgenním myším kmenem exprimujícím γδTCR se stejnou ligandovou specifitou však ukázaly, že γδT buňky jsou schopny dozrát i v nepřítomnosti ligandů . Chien a spolupracovníci použili k identifikaci ligandově specifické populace γδT buněk metodu tetramerního barvení, aby prozkoumali význam endogenních ligandů γδTCR u netransgenních myší. Výsledky jasně ukázaly, že počet ligand-specifických γδT buněk byl srovnatelný mezi ligand-suficientními a -deficientními myšmi, což naznačuje, že většina γδT buněk se během diferenciace thymu nesetkala s ligandy . Autoři také poskytli důkaz, že některé γδTCR mohou signalizovat nezávisle na ligandu . Tato pozorování jsou zjevně v rozporu s předchozím modelem, podle něhož závazek k linii γδT vyžaduje interakci s ligandem γδTCR . Vzhledem k tomu, že polyklonální γδT buňky reagující na určité exogenní ligandy se diferencují a funkčně dozrávají v thymu, je pravděpodobné, že pozorování u některých transgenních myších linií γδTCR neodrážejí většinu γδT buněk s polyklonálními γδTCR.

Pro zkoumání vlivu selekčního signálu γδ na diferenciaci αβT/γδT jsme použili myši s deficitem Lat, u nichž je diferenciace γδT buněk zastavena ve stadiu CD5- prekurzorů. Prekurzorové buňky γδTCR+ byly purifikovány z dospělých Lat-deficientních myší, infikovány retroviry exprimujícími Lat a kultivovány na monovrstvách stromálních buněk (obr. 2a). Tento experiment umožňuje přímé hodnocení fenotypu buněk před a po selekci γδ za podmínek bez ligandů. Ve srovnání s netransdukovanými kontrolními buňkami vykazovaly γδT buňky exprimující Lat výraznou indukci povrchové exprese CD5 (obr. 2b), stejně jako mRNA exprese γδT buněčných signaturních genů (Tcrd, Egr3, Runx3 a Bcl-2) a úplné zrušení transkripce genů spojených s prekurzorovými DN buňkami a αβT buňkami (Rag1, Rag2 a Ptcra) (obr. 2c). Tyto výsledky naznačují, že signál γδTCR jednak pohání diferenciaci směrem k linii γδT, jednak potlačuje diferenciaci do linie αβT způsobem nezávislým na ligandu.

Ačkoli jsou mechanismy, kterými pre-TCR a γδTCR řídí procesy diferenciace do linií αβT, respektive γδT, stále nepochopitelné (a diskutované), je pravděpodobné, že selekce γδ, přinejmenším u většiny přirozeně vzniklých buněk γδT, není podmíněna kognátním ligandem γδTCR v thymu.

Síla signálu γδTCR určuje diferenciaci γδT17/γδT1

Během vývoje obou linií αβT a γδT je exprese Syk a Zap70 inverzně regulována: Syk je vysoce exprimován v časných stadiích (DN1-3 a γδ prekurzor) a poté je jeho exprese snížena, zatímco Zap70 je exprimován v pozdějších stadiích (po β-selekci nebo γδ-selekci) . γδT buňky, které prošly γδ-selekcí, exprimují vysoké hladiny Zap70 i γδTCR/CD3 komplexy a mohou reagovat na endogenní ligandy, pokud jsou v thymu k dispozici. V současné době je známo, že na rozdíl od buněk αβT neprocházejí buňky γδT pozitivní selekcí řízenou ligandy nebo klonální delecí v thymu. Několik studií naznačuje, že interakce s ligandem γδTCR v thymu místo toho řídí efektorovou funkci γδT buněk.

S využitím tetramerového barvení populace γδT buněk, která reaguje na neklasické molekuly MHC třídy I T10 a T22, Chienova skupina zjistila, že antigen-naivní γδT buňky, které se vyvíjely v nepřítomnosti ligandů, přednostně produkovaly IL-17, zatímco antigen-experienční γδT buňky, které se vyvíjely v přítomnosti ligandů, převážně produkovaly IFNγ . Tato studie poprvé vyslovila myšlenku, že silný signál γδTCR vyvolaný ligandem a slabý signál γδTCR vyvolávají buňky γδT1 a γδT17. Nedávná studie s nově vytvořenými T10/T22-deficitními myšmi přinesla v podstatě stejné výsledky, což podporuje tento „model síly signálu“ . Tento model byl dále podpořen dalšími studiemi. Zrání thymu a efektorová diferenciace buněk Vγ5Vδ1 γδT vyžaduje Skint1 (a pravděpodobně i další proteiny rodiny Skint), předpokládaný kostimulační protein pro Vγ5Vδ1 TCR . Při absenci Skint1 jsou Vγ5Vδ1 γδT buňky nesprávně směrovány k fenotypu γδΤ17 buněk na úkor fenotypu γδΤ1 buněk . Kromě toho vývoj γδT1 buněk vyžaduje také kostimulaci prostřednictvím CD27, proteinu nadrodiny receptorů TNF, který je exprimován v γδT1 buňkách, ale ne v γδT17 buňkách . Nedávno Penningtonova skupina identifikovala thymické bipotentní γδT buňky (CD24lo CD44lo CD45RBlo), které mohou dát vzniknout jak γδT17 buňkám, tak γδT1 buňkám. V orgánové kultuře fetálního thymu byl vývoj γδT17 buněk inhibován silnými signály TCR vyvolanými stimulací protilátkami anti-TCRδ nebo anti-CD3ε, ale tyto účinky byly zrušeny farmakologickou inhibicí dráhy MEK/ERK . Tyto údaje poskytují přímý důkaz na podporu myšlenky, že síla signálu γδTCR je rozhodujícím faktorem efektorové funkce buněk γδT.

Na transkripční úrovni silný signál γδTCR indukuje expresi transkripčních regulátorů spojených s γδT1, jako jsou Egr2, Egr3 a Id3, což vede k osudu buněk γδT1 . Id3 inhibuje přijetí buněčného osudu γδT17 inhibicí transkripční regulace zprostředkované HEB (kódované Tcf12) . HEB se může přímo vázat před počáteční místa transkripce Sox4 a Sox13 a podporovat jejich expresi. Tyto transkripční faktory spojené s γδT17 jsou nezbytné pro expresi nezbytného transkripčního faktoru RORγt (kódovaného Rorc) a signálního proteinu Blk . Vzhledem k těmto skutečnostem model síly signálu TCR jasně ukazuje mechanismy, kterými signál TCR řídí efektorovou funkci buněk γδT.

Řada studií však prokázala dopad genetické ablace signálních molekul TCR na efektorovou funkci buněk γδT, což zpochybňuje představu, že síla signálu γδTCR sama o sobě určuje diferenciační osud γδT17/γδT1. Zap70 W163C mutantní myši vykazují úplnou ztrátu vývoje Vγ6+ γδT17 buněk, ale mají normální vývoj γδT1 buněk, zatímco signály TCR jsou u těchto myší utlumeny . Další studie Silva-Santose a spolupracovníků ukázala, že myši haploinsuficientní pro CD3δ a CD3γ (CD3DH), které mají nižší expresi komplexů γδTCR/CD3 na povrchu buněk a zhoršenou signalizaci γδTCR, vykazovaly výrazné snížení thymického vývoje Vγ6+ γδT17 buněk i γδT1 buněk, nikoli však Vγ4+ γδT17 buněk, což naznačuje, že subsety γδT17 vyžadují pro svůj vývoj odlišnou sílu signálu γδTCR . Přestože vývoj αβT buněk a přenos signálu αβTCR nebyly u myší CD3DH ovlivněny, je tento myší kmen zatím jediným zvířecím modelem, u kterého byla prokázána specifická inhibice signalizace γδTCR. Zůstává nejasné, proč jsou γδT buňky specificky postiženy u myší CD3DH, ale je pravděpodobné, že odlišné složení TCR-CD3 komplexů αβT a γδT buněk vysvětluje jedinečný fenotyp myší CD3DH. V této souvislosti je třeba poznamenat, že myši s mutací CD3ε C80G, která není schopna vyvolat konformační změny v TCR, rovněž vykazují narušený vývoj buněk γδT17, ale normální vývoj buněk γδT1 .

Syk je nutný pro diferenciaci γδT17

Nedávno jsme uvedli nový regulační mechanismus, kterým proximální kinázy γδTCR Syk a Zap70 diferenciálně kontrolují indukci γδT17 . Myši s deficitem Syk vykazují úplnou ztrátu buněk γδT17 (jak podskupiny Vγ4+, tak Vγ6+) v thymu. Je pozoruhodné, že nucená exprese Zap70 v T-progenitorových buňkách s deficitem Syk nedokázala obnovit tvorbu γδT17 buněk, což naznačuje, že Syk nehraje v diferenciaci γδT17 zásadní roli. Vzhledem k tomu, že γδT buňky s deficitem Syk, ale nikoli Zap70, vykazují významné snížení fosforylace Akt vyvolané stimulací γδTCR, ukazuje se, že Syk zprostředkovává aktivaci dráhy PI3K-Akt vyvolanou γδTCR. PI3K-deficientní myši (p110γ-/- p110δ-/-) vykazují úplnou inhibici vývoje γδT17 buněk, ale nejsou ovlivněny, pokud jde o γδ-selekci (zvýšení regulace CD5) nebo vývoj γδT1. Bylo prokázáno, že inhibice PI3K snižuje expresi transkripčních faktorů spojených s γδT17 (Rorc, Sox13 a Sox4), což naznačuje klíčovou roli dráhy PI3K-Akt při indukci diferenciačního programu γδT17. V souladu s tím předchozí zpráva prokázala, že kinázově neaktivní PI3Kδ nebo PI3Kγ deficientní myši vykazují výrazné snížení počtu periferních γδT17 buněk a zlepšení zánětu závislého na γδT17 . Dráha PI3K-Akt je rovněž nutná pro diferenciaci αβT (Th17) buněk produkujících IL-17 , což naznačuje, že tato signální dráha je společným regulačním mechanismem sdíleným liniemi αβT a γδT pro indukci prozánětlivých podskupin produkujících IL-17 .

γδTCR indukovaná aktivace dráhy PI3K-Akt závisí na Syk, ale ne na Lat, což naznačuje, že Syk řídí dráhu PI3K-Akt pro indukci diferenciace γδT17 vedle hlavní signální dráhy závislé na Lat, která indukuje selekci γδ . Není jasné, zda Syk aktivuje dráhu PI3K/Akt v buňkách γδT přímou interakcí nebo nepřímým způsobem. Předchozí studie uváděla, že Rasgrp1-deficientní myši vykazují efektorový fenotyp γδT buněk podobný fenotypu PI3K-deficientních myší (tj. úbytek γδT17 buněk a nárůst γδT1 buněk) . Vzhledem k tomu, že Rasgrp1 může fungovat jako předřazený aktivátor dráhy PI3K/Akt v signalizaci αβTCR , je pravděpodobné, že Rasgrp1 přenáší signály z γδTCR na PI3K, aby indukoval diferenciaci γδT17.

Preferenční ztráta γδT17 buněk byla také zaznamenána u myší s nedostatkem Blk, kinázy rodiny Src exprimované v γδT buňkách i B buňkách, ačkoli její funkce v přenosu signálu γδTCR není známa .

Zap70 kontroluje určité podskupiny γδT buněk

Prokázali jsme také roli Zap70 v thymické diferenciaci γδT buněk . Myši s deficitem Zap70 vykazují výrazné snížení počtu Vγ6+ buněk, z nichž většina je γδT17, ale nejsou ovlivněny, pokud jde o vývoj jiných γδT buněk, včetně Vγ1+ i Vγ4+ podskupin. Úroveň exprese proteinu Zap70 byla skutečně nejvyšší v podskupině Vγ6+ mezi buňkami γδT. Vzhledem k tomu, že exprese CD5 byla u Vγ6+ buněk s deficitem Zap70 nižší než u kontrolních buněk, je Zap70 pravděpodobně nutný pro dozrávání Vγ6+ buněk v thymu. V našich pokusech měly Zap70-deficientní myši normální thymickou diferenciaci Vγ4+ buněk, včetně γδT17 podskupiny, což je v rozporu s předchozí zprávou, ve které hypomorfní mutace Zap70 způsobila snížení počtu thymických Vγ4+ γδT17 buněk . Tento rozpor může být způsoben rozdílnými myšmi použitými v obou studiích (Haydayova skupina použila hypomorfní mutantní myši Zap70 na pozadí BALB/c, zatímco my jsme použili kompletně deficientní myši Zap70 na pozadí C57BL/6). Zap70-deficientní myši navíc vykazovaly významné snížení počtu periferních Vγ4+ buněk, které zahrnovaly jak γδT17, tak γδT1 podskupiny, ale měly neporušené Vγ1+ buňky. Na rozdíl od jeho zásadní role ve vývoji αβT buněk je tedy požadavek Zap70 omezen na dozrávání Vγ6+ buněk v thymu a periferní udržování Vγ4+ buněk.

Naše zjištění o rozdílných rolích Zap70 a Syk mohou poskytnout nový klíč k pochopení mechanismů signalizace γδTCR a vývoje γδT buněk. Zap70 je vyžadován pro signalizaci αβTCR a signalizaci γδTCR v určitých podskupinách γδT buněk. V buňkách αβT je aktivace Zap70 závislá na Lck, který je spojen s koreceptory CD4 nebo CD8, které se vážou na pMHC na povrchu antigen prezentujících buněk . Předpokládá se tedy, že Lck-Zap70 je signální osa, která je specializovaná na rozpoznávání antigenu dosažené kontaktem buňky s buňkou; ačkoli v případě γδT buněk zůstává nejasné, jak je Zap70 aktivován navzdory chybějící expresi CD4 a CD8. Naproti tomu Syk je spojen s celou řadou imunoreceptorů, včetně pre-TCR, γδTCR, BCR a FcR . Protože Syk je schopen fosforylovat ITAM a následné cíle nezávisle na kinázách rodiny Src, jako je Lck , mohou být tyto receptory aktivovány nezávisle na ligandu nebo po vazbě na různé rozpustné i povrchové antigeny. Využití Syk nebo Zap70 v imunoreceptorové signalizaci tedy může určovat způsob, jakým receptor rozpoznává antigen. Exprese Syk místo Zap70 skutečně způsobila, že buňky αβT byly schopny reagovat na stimulaci rozpustnou protilátkou anti-CD3, zatímco normální buňky αβT reagovaly pouze na multimerizované protilátky anti-CD3, které napodobují interakci s pMHC na povrchu buněk. Tato zjištění nás vedla k hypotéze, že způsob rozpoznávání antigenu používaný lymfocyty může být určen nejen jejich receptorem jako takovým, ale také odlišným využitím kináz rodiny Syk. Na základě tohoto konceptu předpokládáme, že existují endogenní povrchové γδTCR ligandy, které jsou nutné pro dozrávání Vγ6+ buněk v thymu, stejně jako pro periferní udržování Vγ4+ buněk, a že Vγ1+ buňky nevyžadují povrchové γδTCR ligandy pro svůj vývoj a/nebo udržování.

Procesy indukce γδT17 nezávislé a závislé na γδTCR

Nedávná zpráva elegantně prokázala, že buňky γδT17 vznikají z progenitoru, který je odlišný od ostatních podskupin buněk γδT . Bylo oznámeno, že v populaci dříve klasifikované jako DN1d (CD44+CD25-c-kit-CD24hi) thymocyty byly identifikovány intrathymické progenitory fetálního původu exprimující vysoké hladiny Sox13. Tyto Sox13+ progenitory daly přednostně vzniknout γδT17 buňkám v rekonstituovaném fetálním thymu, zatímco jiné progenitory v rámci populace DN2 nikoli. Nejdůležitější je, že Sox13+ progenitory byly detekovatelné a jejich programy linie γδT17 byly neporušené u myší s deficitem TCRδ nebo Rag, což naznačuje, že osud linie γδT17 je „předurčen“ vnitřním mechanismem nezávislým na γδTCR. Předchozí zpráva však ukázala, že buňky γδT17 se mohou vyvíjet od stadia DN2 (CD44+CD25+c-kithi) při společné kultivaci na monovrstvě stromálních buněk exprimujících ligand Notch . Možná je tedy potřeba nově definovat diferenciační stadia a vztahy mezi progenitory a potomky ve vývoji γδT buněk.

Obrázek 3 shrnuje diferenciační procesy γδT buněk i αβT buněk a zdůrazňuje rozdíly v požadavcích na signály αβ/γδTCR a kinázy rodiny Syk. Časné kroky diferenciace, tj. β-selekce pro linii buněk αβT a γδ-selekce pro linii buněk γδT, jsou řízeny signálem pre-TCR nebo γδTCR nezávislým na ligandu, který slouží jako kontrolní bod pro buňky exprimující funkční řetězec TCRβ, respektive γδTCR. Tyto signály nezávislé na ligandu jsou iniciovány Sykem, který je exprimován v DN thymocytech, včetně prekurzorů γδT. V buněčné linii γδT je signál γδTCR zprostředkovaný Sykem rovněž nutný pro primární diferenciaci buněk γδT17 prostřednictvím aktivace dráhy PI3K. Během β-selekce i γδ-selekce je exprese Syk a Zap70 inverzně regulována: Syk se snižuje, zatímco Zap70 se zvyšuje při signalizaci pre-TCR nebo γδTCR. Proto pozdější krok v diferenciaci linie αβT závisí na signalizaci αβTCR zprostředkované Zap70, která umožňuje DP thymocytům rozpoznat pMHC na povrchu TEC, aby mohly být pozitivně nebo negativně selektovány podle síly interakce αβTCR-pMHC. Naproti tomu Zap70 zprostředkovaná signalizace γδTCR v reakci na endogenní ligandy určuje efektorovou funkci γδT buněk: silný signál indukuje γδT1, zatímco slabý/žádný signál indukuje γδT17.

.