TESTOVACÍ METODY PRO FOTOTOTOXICITU A ALTERNATIVY NA ZVÍŘATECH

Je nezbytné zajistit fotobezpečnost chemických látek, pokud existuje možnost expozice člověka, což lze jasně ilustrovat na příkladu léčiv (20) nebo kosmetiky (21). Pro hodnocení potenciální fototoxicity chemické látky byly zavedeny různé zkušební metody, které sahají od in silico(22), in chemico(23), in vitro až po zkoušky in vivo. Byly vyvinuty a rutinně používány testy in chemico, jako je tvorba ROS (24), testy in vitro, které zahrnují test 3T3 NRU a 3D model epidermis, a studie in vivo využívající morčata, myši nebo pigmentované potkany (25).

Zdroj světla pro fototoxicitu. Zdroj světla pro fototoxicitu je nesmírně důležitý, protože vlnové délky absorbované zkoušenou chemickou látkou (absorpční spektrum) a dávka světla (dosažitelná za přiměřenou dobu expozice) by měly být dostatečné k vyvolání fototoxicity (26). Za ideální umělý zdroj světla se považují solární simulátory, které simulují přirozené sluneční světlo (obr. 5).

Rozložení výkonu ozáření filtrovaného solárního simulátoru by se mělo blížit rozložení výkonu venkovního denního světla. Solární simulátory jsou vybaveny xenonovými oblouky nebo (dopovanými) rtuťovo-metalhalogenidovými oblouky. Měly by být také vhodně filtrovány, aby tlumily vysoce cytotoxické vlnové délky UVB. Spektrum zaznamenané pod těmito filtry by se nemělo lišit od standardizovaného venkovního denního světla (specifikace: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).

Pro kontrolu intenzity a vlnové délky lze nicméně použít i jiný zdroj UVA světla, například UVA lampu, s vhodným UV dozimetrem. Intenzita světla (ozáření) se mění v závislosti na zdrojích a měla by být pravidelně kontrolována před každou zkouškou fototoxicity pomocí vhodného širokopásmového UV-metru. UV-metr musí být před každým měřením kalibrován. V souladu s tím závisí doba ozařování na intenzitě světelného zdroje (např. pro světelný zdroj 1,7 mW/cm2 je pro dosažení 5 J/cm2 nutná doba expozice 50 min). Doba ozařování se rovněž liší v závislosti na zkušebních metodách. Bylo zjištěno, že dávka 5 J/cm2 (měřená v rozsahu UVA) není cytotoxická, ale je dostatečně silná, aby excitovala chemické látky a vyvolala fototoxické reakce v testu absorpce neutrální červeně 3T3.

3T3 Test absorpce neutrální červeně. Test 3T3 NRU byl oficiálně schválen OECD a potvrzen jako OECD TG432 dne 13. dubna 2004 (3). Tato zkouška hodnotí fotocytotoxicitu stanovením relativního snížení životaschopnosti buněk po expozici zkoušenému předmětu v přítomnosti a bez přítomnosti UV/VIS záření. Rozhodnutí provést zkoušku fototoxicity 3T3 NRU se přijímá pro chemické látky, které po rozpuštění ve vhodném rozpouštědle vykazují absorpční spektra v UV/VIS oblasti (17). Bylo navrženo, že pokud je molární extinkční/absorpční koeficient menší než 10 l x mol-1 x cm-1, je nepravděpodobné, že by chemická látka byla fotoreaktivní (např. v UV kyvetě s 1 cm dlouhou světelnou cestou musí být OD 0,05 M roztoku menší než 0,5, aby byl považován za nefotoreaktivní na základě rovnice „absorbance = extinkční koeficient x délka cesty x koncentrace“) (26). Test 3T3 NRU vykazuje vysoce citlivou, ale nízkou specifickou prediktivní schopnost (citlivost 93 % a specifičnost 84 %). Test 3T3 NRU má mnoho omezení. Nemůže předpovědět jiné nežádoucí účinky než foto(cyto)toxicitu, které mohou vzniknout kombinovaným působením chemické látky a světla, jako je fotogenotoxicita, fotoalergie (fotosenzibilizace) nebo fotokarcinogenita. Zkouška 3T3 NRU se používá pouze pro identifikaci nebezpečnosti, zatímco její užitečnost pro hodnocení fototoxické účinnosti není opodstatněná. tento zkušební systém zejména postrádá metabolickou aktivitu, která je rozhodující pro projevy systémově vystavených chemických látek. Proto se u systémově exponovaných chemických látek, které vyžadují metabolickou aktivaci, jako je monokrotalin, riddelliin a heliotrin (pyrolizidinové alkaloidy) (28), doporučují studie in vivo na zvířatech (5,29).

Základním principem testu 3T3 NRU je porovnání životaschopnosti buněk v přítomnosti nebo nepřítomnosti UV/Vis záření, jak je stanoveno pomocí vitálního barviva, neutrální červeně, což je slabé kationtové barvivo, které snadno proniká buněčnými membránami a intracelulárně se hromadí v lysozomech životaschopných buněk. Základní buněčnou linií jsou buňky Balb/c 3T3, což je myší fibroblast vyvinutý z myších embryí G. T. Todarem v roce 1968. Označení 3T3 znamená „3denní přenos, inokulum 3 × 105 buněk“ na misce o ploše 20 cm2 a tato buňka je relativně stabilní, snadno dostupná a snadno se s ní manipuluje (30). Dermální fibroblast je jednou z cílových buněk fototoxicity, což poskytuje pádné odůvodnění pro použití buněk 3T3.

Pro rozhodnutí, zda je zkoušený předmět fototoxický, či nikoli v testu 3T3 NRU, se získá odpověď na koncentraci v přítomnosti a v nepřítomnosti ozáření. Vypočítá se fotoiritační faktor (PIF) nebo střední fotoefekt (MPE) (31). PIF je poměr IC50 (koncentrace, která snižuje životaschopnost buněk o 50 %) neozářených oproti ozářeným, jak je znázorněno na obr. 7.

Model predikce fotocytotoxicity pomocí PIF (faktoru fotodráždivosti).

Když nelze získat IC50, vypočítá se MPE podle následující rovnice

PIF < 2 nebo MPE < 0,1 předpovídá: „žádná fototoxicita“. PIF > 2 a < 5 nebo MPE > 0,1 a < 0,15 předpovídá: PIF > 5 nebo MPE > 0,15 předpovídá: „pravděpodobná fototoxicita“: „

Výpočet fotoúčinku: Fotoefekt (PEC) při libovolné koncentraci C je definován jako součin účinku odezvy (REC) a účinku dávky (DEC), tj. Definice je znázorněna podle (31). Výpočet fotoefektu při koncentraci 0,4 podle rovnic uvedených v textu dává: reakční účinek RE0,4 = (66 % – 11 %)/100 % = 0,55, dávkový účinek DE0,4 = (0,4/0,16 – 1)/(0,4/0,16 + 1) = 0,43 a fotoefekt PE0,4 = 0,24. Průměrný fotoefekt se získá zprůměrováním hodnot fotoefektu při různých koncentracích (31).

Zkouška hemolýzy erytrocytů. Buněčné membrány jsou zranitelné vůči fotochemicky generovaným ROS a radikálům. Poškození erytrocytů vyvolané UVA zářením a následná hemolýza (fotohemolýza) se využívá k posouzení fototoxického potenciálu zkoušených předmětů (32). Ovčí červené krvinky (SRBC) se inkubují s chemickými látkami a ozařují se UVA zářením o intenzitě 20 J/cm2. Po ozáření byly SRBC inkubovány ve tmě po dobu 2 h při pokojové teplotě a poté po dobu další 1 h při 37 ℃, poté byla měřena hemolýza pomocí Drabkinova činidla a měření UV absorbance při 540 nm. Rozsah fototoxicity byl hodnocen podle uvolňování hemoglobinu ze SRBC, tj. fotohemolytické aktivity podle rovnice (33).

• ADE: optická hustota exponovaného roztoku léčiva s erytrocyty

• AD: optická hustota exponovaného roztoku léčiva bez erytrocytů

• C: optická hustota kontrolního 100% hemolytického roztoku

Fototoxikanty jako ciprofloxacin, norfloxacin nebo enoxacin významně zvyšují fotohemolytickou aktivitu nad 20 % při 100 μg/ml. Citlivost, specifičnost a přesnost tohoto testu byly 67 %, 73 % a 73 % pro 24 chemických látek (8 vonných látek, 5 UV absorbérů, 4 léčiva, 4 antimikrobiální látky a 3 barviva) ve srovnání s testem na morčatech in vivo (34). Nízká citlivost může být problematická a její výkon je mnohem horší než u testu 3T3 NRU, což může vysvětlovat snížené používání tohoto testu v poslední době.

In vitro model lidské 3D epidermis. K překonání omezení buněčných metod in vitro se zkoumá možnost použití 3D modelu rekonstruované epidermis pro testy fototoxicity (35,36). Princip testu je v podstatě podobný testu 3T3 NRU, a to hodnocení rozdílu životaschopnosti tkáně v přítomnosti a nepřítomnosti UV/VIS záření. Lze využít podobný predikční model využívající PIF a MPE (37). V modelu 3D epidermis však lze testovat materiály nerozpustné ve vodě a v primárních keratinocytech v epidermální vrstvě je zachována určitá míra metabolické kapacity, která se může uplatnit u toxických látek vyžadujících metabolickou aktivaci (38). Kromě toho je možné měření produkce cytokinů, jako je IL-1β (interleukin-1β) (39), kometový test (40) a histologické vyšetření, které lze vzít v úvahu při dalším hodnocení fotoalergenity a fotokarcinogenity.

In vivo metody využívající morče, myš nebo pigmentované potkany. Laboratorní zvířata, jako jsou myši a morčata, se používají k simulaci reálného scénáře fototoxicity pro člověka. Zvířata jsou vystavena chemickým látkám lokálně nebo systémově a ozařována vhodnou dávkou UVA (obvykle 10 J/cm2 pro test na morčatech, 20 J/cm2 pro test na myších (41)). Bodové hodnocení erytému a edému od 0 do 4 se sečte a maximální skóre během 72 hodin pozorování se zprůměruje pro každé zvíře, aby se vytvořil index dráždivosti. Index fototoxicity se získá podle rovnice „index podráždění ozářeného místa UVA – index podráždění neozářeného místa“ (42). Index fototoxicity vyšší než 0,6 ukazuje na možnost fototoxicity. Alternativně lze k odhadu edému při testech na myších měřit tloušťku ucha. Tyto testy in vivo dobře odrážejí patofyziologický proces fototoxicity u člověka, ale obětování zvířat, náklady a čas potřebný k provedení testu představují mnoho problémů, zejména v době rozšířeného povědomí o dobrých životních podmínkách zvířat a etice. V dnešní době získávají na popularitě testy fototoxicity, které nejsou založeny na zvířatech, aby se tyto problémy překonaly (43).

In chemico metody pro hodnocení fototoxicity. Pro hodnocení fototoxicity byly zkoumány bezbuněčné metody ve zkumavkách, konkrétně metody in chemico. K předpovědi fototoxicity byly analyzovány informace o světelné absorbanci a fotostabilitě zkoušeného předmětu (44). Pomocí generace reaktivních forem kyslíku během fotoexcitace a následné fotoreakce lze vyhodnotit fototoxický potenciál chemické látky in chemico (12). Singletový kyslík se zjišťuje bělením p-nitrosodimethylanilinem (RNO), zatímco ke stanovení tvorby peroxidu se používá Nitro Blue-Tetrazolium Test (NBT-formazanová reakce), jak je znázorněno níže (24),

• Singletový kyslík + imidazol

• → → oxidovaný imidazol

• + RNO

• → bělení RNO + produkty

Test generace ROS vykazuje citlivost a specifičnost 90 % a 76 %.9 % pro kosmetické přípravky a 100 % a 75 % pro nekosmetické chemické látky. Aktivita štěpení řetězců DNA je dalším způsobem hodnocení fototoxicity různých druhů chemických látek nebo léčiv vyvolané UV zářením v chemii prostřednictvím kvantifikace otevřené nebo uzavřené kruhové DNA. Tento test také nevyžaduje živé buňky nebo tkáně, ale plazmid. Plazmid se rozpustí v pufru a smíchá se s testovanými předměty. Po ozáření směsi UV zářením se vzorky podrobí elektroforéze. Množství zlomené DNA se analyzuje pomocí fluorescenční technologie. Výsledkem UV indukované fototoxické sloučeniny je otevření řetězců DNA a je závislé na koncentraci léčiva a dávce UV záření (33). Tyto testy nevyžadují živé buňky nebo tkáně, které mohou zvyšovat variabilitu výsledků testů. Tyto metody však mají omezení, která zahrnují nedostatečnou schopnost metabolické aktivace, nepoužitelnost u materiálů nerozpustných ve vodě (oleje, pevné látky, gely, formulované produkty) a neschopnost předpovědět fotogenotoxicitu, fotoalergii(fotosenzibilizaci) nebo fotokarcinogenitu. Tato zkouška je omezena na identifikaci nebezpečnosti, nikoli na posouzení fototoxické účinnosti.

.