Savčí pohlavní chromozomy mají specializované role ve vývoji mužských (XY) a ženských (XX) pohlavních buněk (1). Abnormality pohlavních chromozomů jsou nejčastější genetickou příčinou lidské neplodnosti (2). U trizomie pohlavních chromozomů (SCT) Klinefelterova syndromu (XXY) a syndromu dvojitého Y (XYY) je spermatogeneze narušena nadbytkem genů X, respektive Y (2). Muži XYY jsou běžně plodní v důsledku spontánní ztráty nadbytečného pohlavního chromozomu (mozaika). U mužů XXY je mozaika méně častá. Odběr spermií z varlat umožnil reprodukci u některých mladých Klinefelterových mužů, ale u starších pacientů je méně úspěšný (3, 4). XXY a XYY jedinci bez zárodečných buněk XY jsou neplodní.

Pro studium neplodnosti SCT jsme vytvořili dospělé XXY a XYY myši nesoucí fluorescenční reportérové transgeny Blimp1-mVenus (BV) a Stella-ECFP (SC) (5) pro sledování diferenciace pluripotentních kmenových buněk na primordiální zárodečné buňky podobné buňkám (PGCLC) (6). XXY samci byli vytvořeni pářením divokého typu samice se samcem s variantou pohlavního chromozomu, který produkuje spermie obsahující XY (obr. S1). Vytvoření XYY myší vyžaduje dědičnost chromozomu Y od obou rodičů. Proto jsme použili paternálně děděný Y chromozom divokého typu a maternálně děděný chromozom Yd1, který neexprimuje testis-determinant Sry (obr. S1) (7). Jak bylo ukázáno dříve (8, 9), fenotyp spermatogeneze u obou modelů rekapituloval fenotyp u mužů s SCT, se zástavou v prospermatogoniálním stadiu u myší XXY a v pachynémě u myší XYY (obr. S2). Spermatogeneze byla normální u euploidních transgenních sourozenců XY BVSC.

Dále jsme stanovili fibroblasty z SCT a kontrolních XY a XX myší (obr. 1A). DNA-fluorescenční in situ hybridizace (DNA-FISH) pro X gen Slx a Y gen Sly potvrdila, že SCT a kontrolní fibroblasty si ve 4. pasáži (P4) zachovaly původní komplexy pohlavních chromozomů (obr. 1B a obr. S3A). Fibroblasty byly přeprogramovány na indukované pluripotentní kmenové buňky (iPSC) (10) způsobem indukovaným doxycyklinem (Dox). DNA-FISH byla provedena u výsledných iPSC P2 (obr. 1A).

Vysoký podíl linií iPSC odvozených od SCT vykazoval ztrátu pohlavních chromozomů. Od myší XXY jsme pozorovali iPSC XY, XX a XO (obr. 1, C a E). Výskyt ztráty byl podobný pro chromozomy X a Y (P = 0,062, Mann-Whitney test). U myší XYY jsme pozorovali XY a XO iPSC (obr. 1, D a E). Ke ztrátě chromozomu Y u samců XYY docházelo s podobnou frekvencí, jakou jsme pozorovali u kombinace chromozomů X a Y u samců XXY (P = 0,089, Mann-Whitney test). Poté jsme porovnali výskyt ztráty pohlavních chromozomů mezi iPSC odvozenými od SCT a euploidními iPSC odvozenými od XY a XX. Ztráta pohlavních chromozomů byla častější u SCT- než u iPSC odvozených z euploidních buněk (obr. 1E), a to bez ohledu na mezní hodnotu použitou pro definici ztráty pohlavních chromozomů (obr. S12D).

Ke ztrátě pohlavních chromozomů mohlo dojít během přeprogramování SCT buněk nebo během množení iPSC na P2, což možná poskytovalo proliferační výhodu výsledným euploidním buňkám. Nestabilita pohlavních chromozomů byla skutečně pozorována u pluripotentních kmenových buněk (11, 12). Abychom otestovali druhou hypotézu, analyzovali jsme stabilitu pohlavních chromozomů mezi P2 a P6 v iPSC s vysoce rodičovskými (>90 %) komplementy (obr. S4A). Ztrátu pohlavních chromozomů jsme pozorovali u linií iPSC XX a XXY (P < 0,01, resp. 0,05; Wilcoxon signed-rank test), ale ne u linií iPSC XY a XYY (P = 0,21, resp. 0,66; Wilcoxon signed-rank test). Žádná linie iPSC však nevykazovala více než 15% pokles rodičovského komplementu (obr. S4B). Navíc ztráta pohlavních chromozomů mezi P2 a P6 nebyla trizomická (obr. S4B). SCT odvozené euploidní iPSC XY rovněž nevykazovaly žádnou proliferační výhodu oproti iPSC XXY nebo XYY (obr. S5). Protože SCT fibroblasty byly také karyotypově stabilní (obr. 1B a obr. S3A), ztráta chromozomů je pravděpodobně indukována během reprogramování iPSC a liší se tak od nestability pohlavních chromozomů u pluripotentních kmenových buněk (11, 12). Tento jev označujeme jako ztrátu chromozomů s trizomií (TCL).

Dále jsme zjišťovali, zda euploidní iPSC XY odvozené z fibroblastů SCT vytvoří funkční spermie. Vybrali jsme vysoce euploidní (≥ 80 % buněk XY) P6 iPSC adaptované na médium bez Dox (obr. S6). Pro naše experimenty s XYY byly pro experimenty s PGCLC použity pouze linie iPSC XY, které si zachovaly divoký typ chromozomu Y, nikoli Yd1 (obr. S7). Karyotypizace potvrdila, že všechny linie iPSC XY získané SCT a kontrolní linie iPSC XY byly euploidní (obr. S8). Tyto linie iPSC byly diferencovány (6) přes stav podobný epiblastu za vzniku agregátů PGCLC pozitivních na BV a SC (obr. 2A). BV-pozitivní PGCLC (tab. S1) byly izolovány pomocí fluorescenčně aktivovaného třídění buněk (FACS) (obr. 2B) a transplantovány do testes s deficitem zárodečných buněk W/Wv (Kit mutant) (13).

Spermatogeneze u příjemců byla hodnocena 9 až 10 týdnů po transplantaci. Teratomy, které jsou pozorovány po transplantaci PGCLC odvozených od iPSC (6), byly přítomny u 29 % transplantovaných linií odvozených od XXY a 50 % od XYY (obr. S9). Rekonstituce spermatogeneze, odhalená přítomností spermatogenních kolonií (obr. 2C) a histologickým vyšetřením (obr. 2D), byla pozorována u všech použitých linií iPSC odvozených od XXY a XYY (tab. 1). SCT odvozené XY iPSC se tedy mohou in vitro diferencovat na zárodečné buňky a po transplantaci dokončit spermatogenezi.

Položili jsme si otázku, zda spermie vytvořené transplantací mohou podporovat reprodukci. Intracytoplazmatická injekce spermie (ICSI) s použitím spermií ze dvou XXY- a dvou XYY-odvozených linií iPSC (obr. 2E a obr. S10A) vytvořila zygoty, které se in vitro vyvinuly ve dvoubuněčná embrya (účinnost 76.7 až 87,3 %) (obr. 2F, obr. S10B a tabulka S2) a hrubě normální potomstvo při transplantaci příjemcům (účinnost 46,9 až 59,4 %) (obr. 2G, obr. S10C a tabulka S2). Genotypizace polymerázovou řetězovou reakcí potvrdila, že potomci pocházejí z transplantovaných PGCLC (obr. S10D). Mláďata z linií iPSC odvozených od XXY a XYY vykazovala srovnatelný růst jako mláďata odvozená z kontrolních iPSC XY (obr. S10E). Pozoruhodné je, že mláďata odvozená od XXY a XYY měla euploidní (XY nebo XX) doplňky (obr. S11). Tři zralí samci a tři samice z každé linie iPSC odvozené od XXY a XYY byli navzájem spářeni a všichni byli plodní (obr. 2H a obr. S10F). Spermie z iPSC odvozených od SCT XY tedy dávají vznik chromozomálně normálnímu, zdravému a plodnému potomstvu.

Zabývali jsme se otázkou, zda je TCL specifická pro trizomii pohlavních chromozomů. Protože myší modely s trizomií kompletního autozomu nejsou k dispozici (14), zopakovali jsme naše experimenty na samcích transchromozomických myší Tc1, modelu Downova syndromu s akcesorním lidským chromozomem 21 (hChr.21) (15). Myši Tc1 nesou kazetu rezistence k neomycinu vloženou do hChr.21, jejíž selekce snižuje mozaičnost hChr.21 (15). Dospělé fibroblasty Tc1 jsme proto nejprve obohatili na přítomnost hChr.21 pomocí analogu neomycinu G418 (obr. 3A). DNA-FISH ukázala, že naprostá většina (≥ 96 %) fibroblastů Tc1 si zachovala hChr.21 (obr. 3B a obr. S3B). Tyto fibroblasty Tc1 byly přeprogramovány bez selekce G418 a výsledné iPSC byly analyzovány na P2. Deset z 16 vytvořených linií iPSC (62,5 %) vykazovalo ztrátu hChr.21 u ≥ 10 % buněk (obr. 3, C a D, a obr. S12D). Naproti tomu po odstranění G418 byl hChr.21 zachován ve fibroblastech Tc1 kultivovaných po stejnou dobu, jaká byla použita pro přeprogramování iPSC (18 dní), a v liniích iPSC P6, které měly vysoce rodičovské (>90 % hChr.21 pozitivní) komplexy v P2 (obr. S12, A a B). Došli jsme k závěru, že ztrátu hChr.21 v buňkách Tc1 podporuje spíše reprogramování než odstranění G418, a že tedy TCL ovlivňuje také akcesorní chromozom.

Dále jsme se ptali, zda se TCL vyskytuje v lidských buňkách. Případy ztráty chromozomů byly pozorovány během kultivace lidských trisomických buněk (16, 17), ale jejich prevalence a vztah k reprogramování nebyly systematicky analyzovány. Vybrali jsme lidské linie Klinefelterova syndromu, Downova syndromu a euploidních fibroblastů XY a XX vykazující minimální mozaiku (obr. S13, A a D), přeprogramovali je a stanovili chromozomové komplety výsledných linií iPSC. Pozorovali jsme XY a XX iPSC z fibroblastů s Klinefelterovým syndromem a euploidní iPSC z fibroblastů s Downovým syndromem (obr. S13, B, C, F a G). Ztráta chromozomů byla častější u trisomických než u disomických buněk, což dokazuje, že k TCL dochází i během lidského reprogramování. Frekvence vysoce euploidních linií iPSC však byla nižší než frekvence pozorovaná u myších iPSC odvozených od trisomie (obr. S13, F až H).

Ukázali jsme, že TCL produkuje euploidní iPSC z SCT a autosomálních trisomických myší a pacientů (obr. S12E). U myší mohou výsledné „opravené“ iPSC tvořit funkční spermie, což umožňuje produkci chromozomálně euploidního potomstva od neplodných jedinců s SCT. TCL doplňuje stávající terapie iPSC pro chromozomové abnormality (17-21). Mechanismy, které způsobují TCL, nejsou známy. Buněčné stresy spojené s přeprogramováním mohou selektovat proti trisomickým buňkám a umožnit vznik euploidních buněk. U lidských buněk jsme pozorovali méně časté TCL než u myších (obr. S12D a S13H). I když jsou TCL vzácné, mohly by nabídnout léčbu neplodným pacientům s SCT, u nichž jsou alternativní přístupy neúspěšné. Klinické použití lidských zárodečných buněk vyrobených in vitro je však třeba pečlivě zvážit z etického a právního hlediska (22-24). Kromě toho bude nutné vyvinout kompletní spermatogenezi in vitro, aby se předešlo riziku vzniku teratomů vzniklých transplantací zárodečných buněk.

TCL také umožňuje produkci ženských iPSC z mužských buněk, což nabízí potenciál pro genetickou disekci pohlavního dimorfismu (25). Vytvořením izogenních linií iPSC, které se liší pouze pohlavními chromozomy, by bylo možné pohlavní rozdíly zjištěné při modelování onemocnění iPSC připsat vlivu chromozomů X nebo Y.

.