U člověka projde v klidu do plic a z plic přibližně 5 až 8 litrů vzduchu za minutu. Vzduch se může lišit koncentrací kyslíku a CO2, může nést alergeny a propůjčuje různou míru mechanického roztažení dýchacích cest a plynových výměnných ploch. Tyto signály jsou snímány, přenášeny a zpracovávány do fyziologických výstupů, jako je řízení plicního krevního tlaku, imunitních reakcí a dechového rytmu, ale mechanismus je nejasný. Plicní neuroendokrinní buňky (PNEC) se vyskytují u celé řady organismů od ryb po savce (1). V plicích savců jsou PNEC jedinými inervovanými epiteliálními buňkami dýchacích cest a představují méně než 1 % celkové populace plicních epiteliálních buněk (2). Ačkoli důkazy in vitro ukazují, že se PNEC podílejí na vnímání kyslíku, tonusu hladkého svalstva bronchů a cév a na imunitních reakcích (1, 3), tyto role nebyly prokázány in vivo. Nedávná studie ukázala, že genetická ablace PNECs u dospělých neohrožuje homeostázu ani obnovu dýchacích cest, což ponechává význam těchto buněk in vivo v nedohlednu (4). Patologie PNEC, zejména zvýšení počtu PNEC, byly dokumentovány u velké řady plicních onemocnění, včetně astmatu, bronchopulmonální dysplazie, cystické fibrózy, chronické obstrukční plicní nemoci, vrozené brániční kýly, neuroendokrinní hyperplazie v dětství, syndromu náhlého úmrtí kojenců a plicní hypertenze (5-8). V každém případě zůstává nejasné, zda je nárůst PNEC příčinou nebo důsledkem příznaků.

V myších plicích se většina PNEC nachází ve shlucích ~3 až 20 buněk nazývaných neuroepiteliální tělíska (NEB) (3, 9). Jak solitární, tak shluková PNEC obsahují husté jádro vezikul, naplněné bioaktivními neuropeptidy, jako je peptid související s kalcitoninovým genem (CGRP), nebo aminy, jako je serotonin (1). Ty se uvolňují v reakci na podněty, jako jsou změny hladiny kyslíku. Neuropeptidy a aminy byly zapojeny do některých stejných procesů jako PNEC (10-12), což zvyšuje možnost, že mohou zprostředkovávat funkci PNEC. Příčinná souvislost však nebyla prokázána in vivo.

Tuto studii jsme zahájili s cílem odhalit mechanismy, které jsou základem vrozené brániční kýly (CDH), vrozené vady spojené se značnou plicní dysfunkcí, včetně zvýšené imunitní odpovědi a plicní hypertenze (13). Na genetickém myším modelu CDH jsme odhalili defekt neúspěšného shlukování PNEC. Následuje sled událostí: zvýšení množství neuropeptidů PNEC, nárůst imunitních infiltrátů a remodelace plicní struktury. Tato zjištění nabízejí in vivo demonstraci funkce PNEC. Protože změny v počtu PNEC a souvisejících neuropeptidů byly zdokumentovány u mnoha plicních onemocnění, mají naše výsledky široký význam i mimo CDH.

U lidí byly mutace v genech pro kruhový receptor (ROBO) spojeny s CDH (13, 14). Abychom mohli studovat defekty plic spojené s CDH, inaktivovali jsme Robo1 i Robo2 v epitelu odvozeném od endodermu, včetně plic, pomocí Shhcre (dále jen Shhcre;Robo mutant) u myší (15, 16). Tito mutanti sice přežívají, ale od 15. postnatálního dne (P) vykazují sníženou plochu pro výměnu plynů (obr. 1, A a B, a obr. S1). Provedli jsme mikroarray s následnou kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí s reverzní transkriptázou (qRT-PCR) v P7, tedy před snížením výměnného povrchu plynů. Patnáct z 20 nejvýše exprimovaných diferenciálně exprimovaných genů se podílí na imunitních reakcích a všechny jsou významně zvýšené, včetně Ccl3, Cxcl2, Tnfa a Saa3 (obr. 1C). V souladu s tímto podpisem jsme pozorovali zvýšený počet imunitních buněk, včetně neutrofilů, eozinofilů, makrofágů a T-buněk (obr. 1, D a E, a obr. S2). Dále došlo ke zvýšení podílu makrofágů M2 a snížení podílu makrofágů M1 (obr. S3). Tato zjištění naznačují, že mutanti Shhcre;Robo vykazují zvýšenou imunitní citlivost, která napodobuje běžnou komorbiditu CDH (13).

Ačkoli je Robo exprimován v alveolární oblasti plicního mezenchymu (obr. S4), jeho exprese v epitelu je omezena na vzácné buňky podél dýchacích cest (obr. 1F). Kolabeling s protilátkou proti CGRP odhalil, že epiteliální buňky exprimující Robo jsou PNEC (obr. 1G). Abychom potvrdili, že geny Robo jsou v rámci PNEC pro svou funkci nezbytné, inaktivovali jsme Robo pomocí Ascl1creERT2 (17), knock-in cre driveru, který propůjčuje PNEC specifickou aktivitu v plicním epitelu (obr. S5). Zjistili jsme, že mutanti Ascl1creERT2;Robo vykazují jak alveolární zjednodušení, tak nárůst makrofágů, čímž rekapitulují fenotypy Shhcre;Robo (obr. S6). Tato zjištění společně ukazují, že Robo je vyžadován specificky v PNEC pro omezení počtu imunitních buněk a zabránění alveolární simplifikaci.

V embryonálním dni (E) 13,5 byly nově specifikované PNEC solitárními buňkami jak v kontrolních, tak v mutantních plicích Shhcre;Robo (obr. 2, A a B). V E 15,5 se většina PNEC u kontrol sdružila do NEB. U mutantů Shhcre;Robo se však PNEC neshlukovaly (obr. 2, C a D). Tento vysoce penetrantní fenotyp přetrvával i v postnatálních plicích (obr. 2, E a F, a obr. S7). Celkový počet buněk PNEC se zdá být neovlivněn, což podporuje normální exprese Ascl1 a dalších markerů PNEC (obr. S8). Neshlukované buňky u mutanta ztrácejí klínovitý tvar a jsou více zaoblené (obr. S7 a S9). Navíc na rozdíl od kontrol, kde solitární PNEC nejsou inervovány (9), je u mutanta inervováno ~33,3 % (31 z 93 buněk) neshlukovaných PNEC (obr. 2F a obr. 3). S9), což naznačuje, že inervace PNEC není závislá na tvorbě klastrů ani na funkci Robo v PNEC.

Mutanti Ascl1creERT2;Robo rovněž vykazují neshlukování PNEC (obr. S10). Tento fenotyp se projevil, i když byla inaktivace Robo indukována postnatálně, což je následně po vzniku NEB. Naše výsledky společně dokazují, že Robo je nutný pro sestavení a udržení PNEC v NEB.

Robo může fungovat buď v závislosti, nebo nezávisle na svém ligandu, Slit (18). Analýza mutantů Slit ukazuje, že zatímco shlukování PNEC není ovlivněno u žádného z jednotlivých mutantů, u mutantů Slit1;3 je sníženo (obr. S11, A až D). Tento výsledek naznačuje, že funkce Robo v tomto procesu je pravděpodobně závislá na ligandu.

Slit a Robo fungují především jako zprostředkovatelé buněčného odpuzování a zřídka přitahování (19). Abychom zjistili, zda Slit působí jako odpudivý nebo přitažlivý signál pro PNEC exprimující Robo, určili jsme nejprve, kde jsou exprimovány geny Slit. Kombinovaný reportér Slit1;2-GFP (zelený fluorescenční protein) odhalil expresi pouze asi v 1 až 3 PNEC v rámci velkých NEB, což zvyšuje možnost, že buňky exprimující Slit1/2 mohou být nukleačními buňkami shluku (obr. S11E). To také naznačuje subspecializaci PNEC v rámci klastru. Exprese Slit3 je omezena na vrstvu hladkých svalových buněk cév obklopujících tepny, která probíhá podél hlavních průdušek, kde se nachází většina NEB (obr. S11, F a G). Těsná blízkost buněk exprimujících Slit k PNEC exprimujícím Robo společně vyvolala možnost, že ligandy Slit mohou poskytovat atraktivní vodítko pro PNEC.

Pro ověření této možnosti byly průtokovou cytometrií vytříděné GAD1-GFP+ PNEC nasazeny do horní komory Boydenovy kultivační vložky pro migraci buněk. Když byl spolu s buňkami v horní komůrce přidán protein Slit, migrovalo do spodní komory o ~52 % méně (P = 8,5 × 10-4) PNEC (obr. S12, J až I). Naopak, když byl protein Slit přidán do spodní komory, migrovalo o 18 % více (P = 7,5 × 10-5) PNECs ke dnu (obr. S11, L až N). Tyto výsledky naznačují, že Slit-Robo pohání shlukování PNEC do NEB, pravděpodobně prostřednictvím buněčné přitažlivosti.

Pro testování možné souvislosti mezi PNEC a imunitní odpovědí jsme testovali expresi neuropeptidů produkovaných PNEC (1). Z devíti testovaných neuropeptidových genů bylo pět významně zvýšeno u mutantů Shhcre;Robo (obr. 3A). Barvení protilátkou proti CGRP ukázalo, že ačkoli jeho exprese v PNECs u mutantů zůstává, intenzita barvení je zvýšená a není již omezena na bazální stranu těchto buněk (obr. S7 a S9). Poznamenáváme také, že zatímco k rozklíčování došlo do E15,5, zvýšení regulace neuropeptidů je pozorováno až po narození, pravděpodobně po vystavení vzduchu (obr. S12).

Pro zjištění, zda zvýšení neuropeptidů přispívá k imunitní odpovědi, jsme se zaměřili na CGRP, protože jeho transkript vykazuje největší zvýšení ze všech testovaných (obr. 3A). Tomuto zvýšení jsme čelili vyšlechtěním mutantní alely Cgrp na pozadí Shhcre;Robo (20). U kontrol Robo ztráta Cgrp nezměnila počet makrofágů (obr. 3, B, D a F). U mutantů Shhcre;Robo však ztráta Cgrp významně snížila počet makrofágů v závislosti na dávce (obr. 3, C, E a F). Zjistili jsme také, že ztráta Cgrp částečně zvrátila fenotyp alveolárního zjednodušení (obr. S13). Poznamenáváme, že ani nárůstu makrofágů, ani alveolárnímu zjednodušení nebylo zcela zabráněno, což naznačuje, že zvýšení dalších neuropeptidů může přispět k následným výsledkům. Tyto výsledky společně poskytují genetický důkaz in vivo, že neuropeptidy zprostředkovávají funkci PNEC.

Jelikož normální alveologeneze začíná v P4 (21), pozdní výskyt alveolárního zjednodušení v P15 naznačuje, že narušení alveologeneze nemusí být primární příčinou. Ačkoli do P10 nebyla pozorována žádná změna v odumírání buněk, došlo ke zřetelnému snížení elastinu (obr. S14), který je možným spouštěčem simplifikace (22). Imunitní buňky, jako jsou makrofágy, exprimují matrixové metaloproteinázy, které degradují elastin (23). Kromě toho je nárůst makrofágů pozorován před simplifikací (obr. S1 a S2), což zvyšuje možnost příčinné souvislosti. Abychom to ověřili, ošetřili jsme plíce Shhcre;Robo a kontrolní plíce klodronátem, hydrofilním lékem, který vyčerpává makrofágy (24). Léčba začínající v P5, tedy před nárůstem počtu imunitních buněk, účinně omezila počet alveolárních makrofágů na výchozí úroveň u mutantů Shhcre;Robo (obr. 4, A až E). To zmírnilo pokles elastinu a zcela zabránilo zjednodušení (obr. 4, F až J, a obr. S15). Společně tato data nabízejí in vivo důkaz, že zvýšený imunitní infiltrát je zodpovědný za alveolární simplifikaci a že obojí je následným důsledkem dysfunkce PNEC.

V této studii předkládáme genetické důkazy in vivo, které ukazují, že PNEC mají navzdory své vzácnosti hluboký vliv na postnatální funkci plic. Ačkoli je defekt PNEC patrný již v E15,5 u mutanta Shhcre;Robo, fyziologické důsledky, počínaje up-regulací neuropeptidů, začínají po narození. To naznačuje, že účinek PNEC je závislý na vystavení plic působení vzduchu. Naše zjištění tedy vymezují způsob přenosu signálu, při kterém jsou PNEC citlivými reostaty na stěně dýchacích cest, které převádějí environmentální signály neautonomně na imunitní odpovědi.

Naše výsledky stanovují Robo1,2 jako soubor genů, které řídí shlukování PNEC do NEB. Představuje také Slit a Robo jako aktéry selektivního třídění buněk v epitelu savčího orgánu. Inaktivace Robo po vytvoření NEB také vedla k rozpadu shluků, což naznačuje, že shluky jsou aktivně udržovány. Ačkoli je známo, že Slit-Robo z velké části zprostředkovávají buněčné odpuzování, naše údaje naznačují, že řídí shlukování PNEC prostřednictvím buněčné přitažlivosti. Inaktivace Robo vedla ke změně inervace a ztrátě bazální lokalizace neuropeptidů. Tyto změny mohou být základem změněného následného vlivu PNEC.

Zvýšení počtu PNEC bylo zdokumentováno u velké řady onemocnění spojených s plícemi, od vzácných poruch, jako je CDH, až po běžné stavy, jako je astma (5-8). Poznamenáváme, že fenotyp PNEC mutantů Robo je odlišný od zvýšeného počtu PNEC. Obojí je však spojeno se zvýšeným množstvím neuropeptidů, které, jak jsme ukázali, jsou silnými efektory funkce PNEC. Naše zjištění tak předpovídají, že zdokumentované patologie PNEC a zvýšení neuropeptidů mohou spíše než jako pasivní čtečka onemocnění sloužit jako aktivní přispěvatelé k symptomům u velké řady respiračních onemocnění.

.