Rostlinný materiál

Listy Strychnos spinosa Lam. byly sebrány v lednu 2013 ve vesnici Sakara, Zaria, Nigérie. Rostlinný materiál identifikoval botanik Musa Muhammad z herbářové sekce katedry biologických věd (Ahmadu Bello University, Zaria), kde byl uložen voucherový exemplář (č. 900161). Nasbírané listy byly usušeny ve větrané místnosti bez znečištění a poté rozemlety na prášek pomocí mlýnku Macsalab (model 2000 LAB Eriez), uloženy ve skleněné nádobě a před použitím uloženy ve tmě při pokojové teplotě (25 ± 3 °C).

Extrakce a frakcionace kapalina-kapalina

Extrakce acetonem, methanolem a dichlormethanem/methanolem

K frakcionaci složek přítomných v různých extraktech listů byla použita variace metody Suffnesse &Dourose. Sušený listový prášek (2 kg) byl třikrát macerován v acetonu (6 l), aby se po filtraci a odstranění rozpouštědla ve vakuu získal acetonový extrakt (AcetE, 75 g). Zbytky byly dále macerovány v methanolu (6 l) stejným postupem, jaký byl popsán výše pro extrakci acetonem, čímž vznikl methanolový extrakt (MetE, 119,2 g). Část sušených práškových listů (1 kg) byla rovněž třikrát extrahována ve směsi (1/1, v/v) dichlormethan/methanol (3 l), aby se po filtraci a odstranění rozpouštědla ve vakuu získal dichlormethan/methanolový extrakt (DcmMetE, 114 g). Část acetonového extraktu (70 g) byla rozpuštěna a frakcionována ve směsi (1/1, v/v) chloroformu a vody za vzniku vodné a chloroformové frakce. k vodné frakci byl přidán n-butanol za vzniku n-butanolové (nButF, 25,1 g) a vodné (Wat1, 5 g) frakce. Chloroformová frakce byla před extrakcí hexanem zahuštěna do sucha a rozpuštěna v 10% vodě v methanolu. Po přidání n-hexanu tak byla získána hexanová frakce (HexF, 23. 9 g) a zbytek 10% vody v methanolu. Podíl vody v methanolu byl zvýšen tak, aby vznikla 35% složka vody v methanolu, která nakonec po přídavku chloroformu poskytla chloroformovou frakci (ChlF, 7,05 g) a 35% frakci vody (wat2, 2,8 g). Ze srovnávací TLC byly frakce vody (Wat1) a 35% vody v methanolu (Wat2) sloučeny do jedné frakce (WatF, 7,8 g).

Extrakce alkaloidů

Listy S. spinosa (1 kg) byly macerovány směsí (96:3:1, v/v) EtOAc-EtOH-NH4OH (600 ml) a poté perkolovány EtOAc za vzniku extraktu (26 g) po odstranění rozpouštědla pomocí rotační odparky za sníženého tlaku. Extrakt byl rozpuštěn v EtOAc a extrahován 4% kyselinou octovou za vzniku EtOAc frakce (EtAcF, 20,02 g). Kyselý roztok (pH 3-4) byl bazifikován na pH (8-9) pomocí Na2CO3 a po odstranění rozpouštědla ve vakuu třikrát extrahován DCM za vzniku surového extraktu alkaloidů (AlkE, 2,8 g).

Antimikrobiální test

Mikroorganismy a příprava inokula

Použité mikroorganismy byly tři grampozitivní bakterie, Bacillius cereus (ATCC 14579), Staphylococcus aureus (ATCC 29213) a Enterococcus faecalis (ATCC 29212), jedna gramnegativní bakterie, Escherichia coli (ATCC 25922); a čtyři houby, včetně tří kvasinek Candida albicans, Cryptococcus neoformans (zvířecí izoláty) a Candida albicans (ATCC 10231) a jedné vláknité houby Aspergillus fumigatus. Některé použité kmeny hub byly kultivovány z klinických případů houbových infekčních onemocnění zvířat před léčbou na katedře veterinárních tropických nemocí veterinární fakulty. C. albicans byl izolován z pěnkavy gouldské, C. neoformans z geparda, zatímco A. fumigatus byl izolován z kuřete, které trpělo systémovou mykózou.

Bakteriální a houbové kultury byly před provedením testu odebrány z 24 hodin čerstvých agarových kultivačních desek a naočkovány do čerstvého Sabouraudova dextrózního bujónu (SDB) pro houby a Muellerova-Hintonova bujónu (MHB) (Fluka, Švýcarsko) pro bakterie. Zákal mikrobiální suspenze byl upraven na McFarlandův standard 0,5, což odpovídá koncentraci 1-5 × 108 a 1-5 × 107 KTJ/ml pro bakterie a houby. Mikrobiální suspenze se dále ředily (1:100) v médiu, aby se získalo konečné inokulum přibližně 1,5 × 106 KTJ/ml pro bakterie a 1,5 × 105 KTJ/ml pro houby.

Stanovení minimální inhibiční koncentrace

K určení hodnot minimální inhibiční koncentrace (MIC) pro extrakty a frakce proti bakteriím a houbám byla použita metoda dvojnásobného sériového mikroředění s tetrazoliovou violetí jako indikátorem mikrobiálního růstu podle úpravy Masoko et al. .

A 100 μl (10 mg/ml) extraktů a frakcí rozpuštěných v dimethylsulfoxidu (DMSO) bylo sériově dvakrát zředěno sterilní destilovanou vodou v 96jamkových mikrotitračních destičkách a do každé jamky bylo přidáno 100 μl čerstvě připravené mikrobiální kultury v MHB nebo SDB. DMSO (5 %) byl použit jako negativní kontrola, zatímco gentamicin a amfotericin B (1 mg/ml) byly pozitivní kontroly. Mikrotitrační destičky byly uzavřeny v plastových sáčcích a inkubovány 24 h při 37 °C. Poté bylo do každé jamky přidáno 40 μl 0,2 mg/ml p-iodonitrotetrazoliové violeti (INT) a mikrotitrační destičky byly dále inkubovány při 37 °C. Minimální inhibiční koncentrace byly stanoveny po 1 a 2 h pro bakterie a po 16 a 36 h pro houby. MIC byla stanovena jako nejnižší koncentrace inhibující mikrobiální růst, což bylo indikováno poklesem intenzity červeného zbarvení formazanu.

Antioxidační testy

Antioxidační aktivita extraktů a frakcí z listů S. S. spinosa byly stanoveny z hlediska schopnosti vychytávat volné radikály pomocí 2,2′-difenyl-1-pikryhydrazylu (DPPH) a 2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonové kyseliny) diamoniové soli (ABTS).

DPPH test

Antioxidační aktivita byla provedena podle popisu Du Toit et al. s drobnými úpravami. Vzorky byly rozpuštěny v methanolu třídy HPLC (Sigma-Aldrich, Německo) a dvakrát sériově naředěny na koncentrační rozmezí 1000 až 7,81 μg/ml pro extrakty a frakce a 40 až 0,31 μg/ml pro standardní referenční kyselinu L-askorbovou (Sigma, Německo). Stručně řečeno, 40 μl (10 mg/ml) vzorků bylo vloženo do 96jamkových mikrotitračních destiček (Bioster, Španělsko) a dvakrát sériově naředěno v methanolu. Poté bylo do každé jamky zavedeno 160 μl (3,7 mg/100 ml) methanolového roztoku 2,2-difenyl-1-pikryhydrazylu (DPPH) a po 30minutové inkubaci při pokojové teplotě ve tmě byla změřena absorbance při 517 nm pomocí multirežimové mikrodestičkové čtečky (BioTek, USA). Aktivita zachycování volných radikálů každého vzorku a referenčního standardu byla stanovena jako procento inhibice získané podle následujícího vzorce:

Přičemž Absample je absorbance extraktu s DPPH, Abblank je absorbance extraktu bez DPPH a Abcontrol je absorbance methanolu a DPPH. Koncentrace vzorků redukujících 50 % volných radikálů DPPH (IC50) byla stanovena vynesením procenta inhibice proti koncentracím vzorků. Test byl třikrát opakován a výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± směrodatná odchylka.

ABTS test

Schopnost extraktů a frakcí zachytávat ABTS radikály byla stanovena metodou Re et al. s drobnými úpravami. Stručně řečeno, ABTS radikál byl generován reakcí 7 mM roztoku ABTS a 2,45 mM roztoku persíranu draselného při pokojové teplotě po dobu 12 h. Absorbance zásobního roztoku ABTS radikálu byla před použitím upravena na 7,00 ± 0,02 při 734 nm. Do mikrotitračních destiček bylo zavedeno 40 μl roztoku extraktů nebo frakcí rozpuštěných v methanolu HPLC (Sigma-Aldrich, Německo) a sériově naředěno na koncentrace v rozmezí 15,62 a 2000 μg/ml. Trolox (Sigma, Německo) a kyselina L-askorbová (Sigma, Německo) byly připraveny v koncentracích od 200 do 1,56 μg/ml. Poté bylo do jamek (kromě slepého pokusu) přidáno 160 μl roztoku ABTS a po 6 minutách inkubace při pokojové teplotě byla změřena absorbance při 734 nm. Trolox a kyselina askorbová byly použity jako pozitivní kontroly, methanol jako negativní kontrola a extrakty nebo frakce bez ABTS jako slepý pokus. Procento inhibice ABTS-+ a IC50 byly vypočteny, jak je uvedeno výše pro DPPH test.

Test cytotoxicity

Citotoxicita acetonových extraktů a frakcí vůči buňkám opičích ledvin Vero byla hodnocena pomocí MTT redukčního testu, jak bylo popsáno dříve s malými úpravami. Buňky byly nasazeny v hustotě 1 × 105 buněk/ml (100 μl) do 96jamkových mikrotitračních destiček a inkubovány při 37 °C a 5 % CO2 ve zvlhčeném prostředí. Po 24hodinové inkubaci byly do jamek s buňkami přidány vzorky (100 μl) v různých konečných koncentracích. Jako pozitivní reference byl použit doxorubicin. Byla také zařazena vhodná slepá kontrola s ekvivalentní koncentrací acetonu a destičky byly dále inkubovány 48 h v inkubátoru s CO2. Poté bylo médium v každé jamce odsáto z buněk, které byly následně promyty PBS, a nakonec bylo do každé jamky přidáno čerstvé médium (200 μl). Poté bylo do každé jamky přidáno 30 μl MTT (5 mg/ml v PBS) a destičky byly inkubovány při 37 °C po dobu 4 h. Médium bylo z jamek odsáto a k solubilizaci vytvořených krystalů formazanu byl přidán DMSO. Absorbance byla měřena na mikrodestičkové čtečce BioTek Synergy při vlnové délce 570 nm. Inhibice růstu buněk pro každý extrakt byla vyjádřena v hodnotách LC50, definovaných jako koncentrace, která způsobila 50% inhibici životaschopnosti buněk. Hodnoty indexu selektivity (SI) byly vypočteny vydělením hodnot cytotoxicity LC50 hodnotami MIC (SI = LC50/MIC). Testy byly provedeny ve čtyřech opakováních a každý experiment byl třikrát opakován.

Statistická analýza

Všechny experimenty byly provedeny ve třech opakováních a hodnoty byly vyjádřeny jako průměr ± směrodatná odchylka. Rozdíly mezi hodnotami byly posouzeny z hlediska významnosti pomocí analýzy rozptylu a výsledky byly porovnány pomocí Fisherovy metody nejmenšího významného rozdílu (LSD) na 5% hladině významnosti.