gen mecA PCR

Fragment o délce 188 bp v genu mecA a fragment o délce 178 bp v genu S. aureus specifického genu Sa442 byly amplifikovány pro izoláty 1 a 2 v samostatných reakcích na LightCycleru (Roche Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Německo) pomocí SYBR green s primery Mec-S a Mec-A nebo Sa442-F a Sa442-RS, jak bylo popsáno dříve (5). mecA pozitivní izoláty generují teplotu tání SYBR green 79 °C. Izoláty pozitivní na Sa442 rovněž generují teplotu tání zelené SYBR 79 °C. S. aureus ATCC 29213 (citlivý na oxacilin) a S. aureus ATCC 43300 (rezistentní na oxacilin) byly použity jako kontroly pro gen Sa442 a jako negativní a pozitivní kontroly pro gen mecA. Na rozdíl od kontrol nebyl u izolátů 1 a 2 vytvořen žádný produkt mecA ani Sa442. Byla provedena další PCR k detekci většího 533-bp fragmentu genu mecA (4). U izolátů 1 a 2 ani u S. aureus ATCC 29213 nebyl generován žádný produkt, ale u S. aureus ATCC 43300 byl generován produkt očekávané velikosti. Gen 16S rRNA, použitý jako pozitivní kontrola, byl amplifikován ze všech kmenů (údaje nejsou uvedeny).

Přesná a včasná detekce rezistence k meticilinu u S. aureus je důležitou funkcí laboratoře klinické mikrobiologie (20). Zatímco detekce genu mecA pomocí PCR je zlatým standardem, latexový aglutinační test PBP2a se ukázal jako jednoduchý a rychlý test s dobrými výkonnostními charakteristikami pro detekci rezistence k meticilinu u S. aureus i koaguláza-negativních druhů stafylokoků, nehledě na nutnost předchozí indukce v některých případech (1, 21). Test PBP2a používá latexové částice senzibilizované monoklonálními protilátkami zvýšenými proti PBP2a (11). Specificita tohoto testu se údajně blíží 100 % (18, 19). Ačkoli neexistují žádné zprávy týkající se účinnosti latexových aglutinačních testů PBP2a pro izoláty S. intermedius, byly zaznamenány falešně pozitivní výsledky PBP2a u dvou izolátů S. warneri, jednoho při 1 min a druhého při 6 min, které byly oba mecA PCR negativní s MIC oxacilinu ≤0,5 μg/ml (21). Podle příbalového letáku výrobce jsou falešně pozitivní reakce obecně slabé aglutinace, které jsou často negativní při opakovaném testování s čerstvou kulturou. Zjistili jsme však, že naše dva izoláty byly opakovaně pozitivní po vícenásobné subkultivaci, přičemž jeden byl silně pozitivní. Kmen S. intermedius ATCC 29663 byl ve skutečnosti negativní v testu PBP2a, ale byl také fenotypově odlišný od obou klinických kmenů, pokud jde o pozitivní manitolovou fermentaci, negativitu β-laktamázy a citlivost na penicilin (výsledky nejsou uvedeny).

Koagulázová pozitivita se běžně používá k přisuzování klinického významu a patogenity izolátům Staphylococcus spp. Zatímco S. aureus je nejčastějším koagulázově pozitivním stafylokokem izolovaným v klinické laboratoři, S. intermedius, S. delphini, S. schleiferi subsp. coagulans, S. lutrae a některé kmeny S. hyicus jsou rovněž koagulázově pozitivní (1). K identifikaci koagulázopozitivních stafylokoků laboratoře často používají kombinaci testů na detekci volné koagulázy nebo shlukovacího faktoru s proteinem A a bez něj. Izoláty S. intermedius jsou pozitivní na volnou koagulázu, ale jsou negativní na protein A, a 14 % izolátů má shlukovací faktor, což by vysvětlovalo pozitivní sklíčko koagulázy a slabě pozitivní BACTi Staph latex u izolátu 1 (6). Jak bylo popsáno dříve, zjistili jsme, že pozitivita pyrrolidonyl arylamidázy je rychlý způsob, jak určit, že koaguláza pozitivní stafylokok není S. aureus (10). Domníváme se, že naše případy naznačují, že skutečný výskyt S. intermedius u infekcí lidských ran je pravděpodobně podhodnocen, protože všechny koaguláza pozitivní stafylokoky jsou často házeny do jednoho pytle jako S. aureus (17). Vzhledem k absenci definitivní identifikace S. intermedius fenotypovými nebo biochemickými metodami se ukázalo, že sekvenování genu 16S rRNA je užitečné pro taxonomickou klasifikaci druhů Staphylococcus a Macrococcus (8).

Původní studie z roku 1989 ukázala, že 72 % izolátů S. intermedius z infekcí dásní a ran způsobených psem bylo citlivých na penicilin a žádný nebyl rezistentní na oxacilin (16). Novější studie odhalila, že rezistence k oxacilinu je u izolátů S. intermedius stále větším problémem, přičemž u izolátů z nosu, očí a abscesů psů byla zaznamenána o 60 až 85 % vyšší míra rezistence k oxacilinu ve srovnání s izoláty z ostatních míst (7). U první lidské infekce způsobené S. intermedius rezistentním na meticilin, kde byl původcem pneumonie, byla MIC oxacilinu 32 μg/ml (3). Oba naše izoláty byly rezistentní k penicilinu a byly β-laktamáza pozitivní; MIC oxacilinu pro tyto izoláty byla 0,125 μg/ml. Rezistenci k penicilinu u těchto izolátů při absenci rezistence k oxacilinu s negativní mecA PCR a citlivosti ke kombinaci inhibitorů β-laktamů a β-laktamáz lze vysvětlit pozitivním nálezem testu na β-laktamázy. Za použití sady primerů zaměřených na 533-bp fragment genu mecA potvrdili Gortel a spol. že gen mecA propůjčuje stafylokokům izolovaným od psů rezistenci k meticilinu (4). Tito badatelé zjistili, že mezi 10 koaguláza-pozitivními stafylokokovými kmeny nesoucími mecA bylo 9 S. aureus a 1 S. intermedius. Předpokládali, že rozdíl v prevalenci rezistence k meticilinu u S. intermedius ve srovnání s S. aureus je způsoben rozdílem v regulaci mecA mezi těmito druhy nebo nedostatkem intenzivního selekčního tlaku na antibiotika u S. intermedius (4). Ačkoli neexistují žádná specifická interpretační kritéria NCCLS pro koaguláza-pozitivní stafylokoky jiné než S. aureus, výsledky testování citlivosti na oxacilin fenotypovými a genotypovými metodami (PCR genu mecA s použitím dvou sad primerů zaměřených na fragmenty o délce 188 a 533 bp) v kombinaci s nízkými MIC na oxacilin ve srovnání s MIC dříve uváděnými pro oxacilin-rezistentní S. intermedius (MIC > 4 μg/ml), určuje izoláty 1 a 2 v této studii jako citlivé na oxacilin (3, 4).

Je všeobecně známo, že rezistence k meticilinu u S. aureus je způsobena především získáním dalšího proteinu vázajícího penicilin, PBP2a, který je kódován genem mecA. Pátrání po původu genu mecA vedlo k identifikaci možného evolučního předchůdce u S. sciuri, komenzála zvířat. Homolog mecA u S. sciuri vykazoval 79,5% podobnost sekvence DNA s genem mecA S. aureus a 88% aminokyselinovou identitu s PBP2a. Homolog mecA S. sciuri neuděluje v přírodě rezistenci k meticilinu. Couto et. al však identifikovali izoláty S. sciuri rezistentní vůči meticilinu od lidí, u nichž nadměrná exprese homologu mecA v důsledku vložení elementu IS256 před strukturní gen nebo jednonukleotidových změn v oblasti promotoru vedla k produkci proteinu funkčně připomínajícího PBP2a (2). Podobně jako izoláty S. sciuri mohou i zde popsané izoláty S. intermedius obsahovat homolog mecA kódující protein podobný PBP2a, který křížově reaguje s latexovým aglutinačním testem PBP2a, ale neuděluje rezistenci k meticilinu. Je také možná antigenní mimikry se zcela nepříbuzným proteinem. V každém případě doufáme, že zvýšíme povědomí mikrobiologické komunity o tom, že existují klinické izoláty, které mohou zpochybnit specifičnost latexového aglutinačního testu PBP2a.

Závěrem uvádíme první zprávu o falešně pozitivních výsledcích PBP2a u dvou kmenů S. intermedius, které v kombinaci s počáteční chybou při interpretaci fenotypových testů vedly k chybné identifikaci jako MRSA. Falešně pozitivní výsledky PBP2a by mohly vést k nesprávně zaměřeným pokusům o kontrolu infekcí, zbytečnému používání antibiotik, jako je vankomycin, a celkovému zvýšení nemocničních výdajů (20). Tyto případy zdůrazňují důležitost aktivního sledování nesouhlasných výsledků laboratorních testů, aby se předešlo chybám při hlášení. Přesná druhová identifikace koagulázopozitivních stafylokoků je nezbytná pro určení patogenity, klinického významu, vzorců citlivosti a epidemiologie klinických izolátů.

.