Výsledky a diskuse

Struktury a energie různých mutovaných modelových systémů KSI byly zkoumány ve třech reakčních krocích: Za prvé, abstrakce protonu C4-β (ES → TS1 → EI1); za druhé, mírná rotace protonovaného Asp-40 (EI1 → TS2 → EI2); a za třetí, donace protonu do polohy C6-β Asp-40 (EI2 → TS3 → EP), jak je znázorněno na obr. 1. 1. Předpokládaný energetický profil WT (obr. 2A) je podobný odpovídajícímu experimentálnímu profilu Pollacka a spolupracovníků (25). Je třeba poznamenat, že při TS2 je substrát částečně neutralizován, protože atomy H katalytických zbytků se přibližují k oxyaniontu (O3) v substrátu a přebytečný elektron přechází ze substrátu na sousední katalytické zbytky cestami H-vazby. Substrát, Tyr-16/57 a Asp-103 tedy sdílejí jednu jednotku záporného náboje a jejich rozložení náboje závisí na protonové afinitě a elektronové afinitě katalytických zbytků mutantů. Tento stav TS2 s katalytickými zbytky je v kontrastu se stavem bez katalytických zbytků, kdy je substrát záporně nabitý téměř o jednu jednotku.

Naše vypočtené trojrozměrné struktury EI (komplexované s equileninem místo steroidu) téměř přesně odpovídají rentgenovým strukturám PI(g′) a TI(g′). V předpovězené struktuře komplexu Tyr-16/57 + Asp-103 + equilenin jsou obě hodnoty vzdáleností d(O3-Or) pro Tyr-16 a Asp-103 (2,54 a 2,55 Å) v dobré shodě s rentgenovými daty (2,6 ± 0,1 Å pro oba v případě PI a 2,58 ± 0,08 Å a 2,62 ± 0,07 Å v případě TI) (32, 33, 36). Protože vypočtené struktury byly optimalizovány bez omezení, shoda v experimentálních a teoretických geometriích naznačuje, že v enzymu mají klíčová rezidua téměř maximální interakce se substrátem bez napětí.

Byla vyslovena domněnka, že v roztoku může mít aktivní místo TI dyadickou strukturu (Asp-99… Tyr-14… equilenin) (29), která se liší od rentgenových struktur TI a PI (32, 33). Nedávný NMR experiment pro PI/ekvilenin však ukázal, že v PI(D40N)/ekvileninu se objevuje charakteristická silná rezonance v dolním poli při 16,8 ppm a slabá při 13,1 ppm (36), podobně jako v případě TI/ekvileninu podle skupin Mildvana (29) a Pollacka (25). Tento výsledek dokazují i naše ab initio výpočty komplexu Tyr-16/57 + Asp-103 + equilenin, v němž je silná rezonance v dolním poli při 16,5 ppm přiřazena Tyr-16. Experiment také ukazuje, že v mutantě D103L + D40N se objevuje silná rezonance v dolním poli (přiřazená Tyr-16), zatímco v mutantě Y16F + D40N silná rezonance mizí. Tento experiment tedy jasně vylučuje dyadickou strukturu, v níž byla silná rezonance v dolním poli přiřazena Asp-103, který je H-vazbou vázán na Tyr-16 (36).

Absolutní rychlostní konstanty lze zkoumat pomocí vypočtených aktivačních bariér. Na úrovních B3LYP/6-31+G* a MP2/6-31+G* je aktivační bariéra WT KSI poněkud podhodnocena ve srovnání s experimentální bariérou (10 až ≈11 kcal/mol), kterou uvádějí Pollack a spolupracovníci (46). Pokud se však vezme v úvahu účinek dielektrického prostředí KSI (31), je aktivační bariéra WT 8,2 kcal/mol, což je v těsném souladu s experimentální hodnotou. Mírné podhodnocení o 2-3 kcal/mol by bylo možné vysvětlit přesnějším výpočtem a úplnějším modelovým systémem zahrnujícím apolární zbytky v okolí aktivního místa. Na rozdíl od absolutní aktivační bariéry jsou relativní aktivační bariéry mezi různými mutantami, a tedy i reakční mechanismus, poměrně konzistentní bez ohledu na úroveň výpočtu, a to z důvodu rušivého efektu mezi různými modelovými systémy s podobným prostředím. Pomocí relativních aktivačních bariér mezi různými mutanty jsme tedy získali relativní reaktivitu (poměr kinetické rychlostní konstanty mutanta k rychlostní konstantě WT) nebo log(kcat/kcat(WT)) s předpokladem, že přenos z ES na TS1 je rychlost určujícím krokem na reakčních drahách (viz poznámka pod čarou v tabulce 1). Výpočty MP2 posilují výsledky získané na úrovni B3LYP. Předpovězené hodnoty log(kcat/kcat(WT)) jsou v dobré shodě s hodnotami naměřenými pro PI (32-35) a TI (25-28, 31) (tab. 1). Vzhledem k tomu, že vysoce homologická trojrozměrná (terciární a kvartérní) struktura a prostředí aktivního místa TI jsou podobné jako u PI, očekává se, že katalytické reakce v obou KSI budou probíhat stejným způsobem.

Obr. 1. 2 ukazuje profily energií a vzdáleností H-vazby pro různé mutanty podél reakční dráhy. Celkové energetické profily (ΔE) (obr. 2A) jsou téměř symetrické vzhledem k TS2. Bariéry prvního a třetího kroku jsou podobné. Druhý krok, který má malou bariéru (≈1 kcal/mol), nemůže být určující pro rychlost, protože zahrnuje pouze mírný posun atomu H prostřednictvím minimální rotace (pouze o několik stupňů, protože Asp-40 je silně skloněn proti rovině substrátu) kolem vazby C-C (nebo vazby C-H na obr. 1 a 3). Reakci lze tedy prakticky považovat za dvoustupňový mechanismus. Rezidua katalyzují první krok tím, že (částečně) darují proton substrátu (jako kyselina), zatímco třetí krok je katalyzován (částečným) přijetím protonu ze substrátu (jako báze). Viz mezikyslíkové vzdálenosti vazeb H a mimostředná vzdálenost sdíleného protonu od středu O3 a Or, kde kladná/záporná hodnota znamená, že proton je blízko zbytků/substrátu.

U kyselých zbytků s nižší protonovou afinitou (pA v plynné fázi nebo pKa v dielektrickém prostředí) by aktivační bariéra byla nižší pro první krok a vyšší pro třetí krok, zatímco u bazických zbytků s vyšší pA nebo pKa by došlo k opačnému efektu. V důsledku toho se ve dvoustupňovém enzymovém mechanismu dosáhne optimálního katalytického výkonu, když zbytky enzymu hrají pro celkovou reakci střídavě dvojí roli velmi silného donoru/akceptoru protonů do/z substrátu (pojmenovat jako amfi-kyselý/bazický katalyzátor nebo protonový/elektronový pufr). V dielektrickém prostředí enzymů je dosaženo maximálního katalytického účinku v případě stejných pKas zbytků a substrátu . Tato situace je na rozdíl od jednostupňových reakcí, kdy velký rozdíl v pKa zvyšuje reaktivitu (47, 48). Podmínka stejných pKas mezi zbytky a substrátem pro maximální katalytický účinek odpovídá požadavku, aby zbytky v enzymu měly ekvivalentní pKas se substrátem pro tvorbu maximálních SSHB (4-7, 15, 23, 24). Ve dvoustupňovém reakčním mechanismu KSI tedy SSHBs jako katalyzátory amfi-kyselin/baz spolu s částečnými protonovými člunky a redistribucí náboje hrají klíčovou roli při silné stabilizaci EIs o ≈15 kcal/mol ve stabilizační energii řízené zbytky a ve zkrácení mezikyslíkové vzdálenosti závislé na reakční cestě vzhledem ke stavu ES .

Stabilizační energie řízená zbytkem ΔΔEa je do jisté míry korelována s ΔdES, pokud nedochází k přenosu protonu ze zbytku na substrát (tj, pokud se ΔrH nenachází v záporné oblasti na obr. 2C). Stabilizaci při EIs a TSs lze tedy korelovat se zkrácením vzdálenosti H-vazby, a tedy i síly H-vazby vzhledem ke stavu ES. To znamená, že normální (nebo obyčejné) H vazby (mezi neutrálními partnery) v ES mají tendenci stát se SSHB (zahrnující iontové druhy) v EIs a TS2. Tyto krátké vazby by tedy měly být zodpovědné za část snížení energie způsobeného rezidui. Pokud jde o přenos protonů, potenciál v ES je u všech mutantů jednoduchou jamkou, zatímco tvar potenciálu (v blízkosti EIs nebo TSs) v oblasti, kde se ΔrH blíží nule (tj. v okolí TS1/EI1 pro c a EI1/TS2 pro e a f na obr. 2C), nese některé charakteristiky dvojité jamky. Pro malou absolutní hodnotu ΔrH (<≈0,5 Å) (obr. 2C) se v našem výpočtu ukázalo, že bariéra pro přenos protonů je velmi malá, a tak samotné přenosy protonů v potenciálu typu dvojité jamky nemohou vysvětlit drastické snížení aktivační bariéry. Případ g, v němž se charakteristiky potenciálu typu double-well téměř vytrácejí při malém přenosu protonů, skutečně vykazuje větší snížení energie než případ f, který zahrnuje přenos protonů v potenciálu typu double-well. Na druhé straně je třeba na obr. 2 D a E poznamenat, že poté, co dojde k přenosu protonů, se ΔdES již nezkracuje, ale mírně prodlužuje, zatímco ΔΔEa se stále snižuje. Samotné zkrácení délky H-vazby (tj. ΔdES) tedy nemůže vysvětlit drastické snížení bariéry u TS a EI (tj. ΔΔEa). Snížení bariéry u TS a EI je tedy třeba vysvětlit dalšími interakčními silami, které budou diskutovány v termínech interakcí molekulárních orbitalů (MO) mezi substráty a zbytky (zahrnujících elektronické přeskupení vyvolané přenosem náboje nebo redistribuci náboje).

V případě dvou konkurujících si zbytků jako v případě f a g vede kumulativní stabilizace EI/TSs k většímu zvýšení kcat. Tento účinek je však poněkud subaditivní (tj. menší než součet stabilizačních energií každého zbytku) v důsledku snížené proton-odtahové síly oxyaniontu pro každý zbytek kvůli přítomnosti druhého zbytku. Tato subaditivita naznačuje, že SSHB budou zahrnovat přenosy náboje a polarizaci (tj. indukované elektrostatické interakce) a případně částečnou kovalentní vazbu. Ve skutečnosti stabilizace EI a TS v přítomnosti katalytických zbytků vyplývá především z delokalizace přebytečného elektronu přítomného v aktivním místě přenosem náboje a polarizací, což bude vidět níže. Efektivní populační náboje přirozených vazebných orbitalů (49) substrátu v případech a, c-e a f u TS1 jsou -0,57, ≈-0,43 a -0,37 v tomto pořadí. Záporný náboj substrátu je tedy v přítomnosti dvou katalytických zbytků více redukován. Tato redukce vzniká přenosem přebytečného elektronu ze substrátu na katalytická rezidua s velkou elektronovou afinitou, která hrají roli pufru pro přebytečný elektron. Ačkoli Asp má silnější schopnost odebírat elektrony než Tyr, Tyr má nižší elektronovou afinitu než Asp. Tyr je tedy při snižování aktivační bariéry stejně účinný nebo o něco účinnější než Asp. Stabilizace TS a EI v přítomnosti katalytických zbytků silně souvisí se snížením energie přebytečného elektronového stavu, protože prostor pro přebytečný elektron se zvětší, když se kromě substrátu přidají i katalytické zbytky. Toto snížení energie přímo souvisí s principem neurčitosti; čím méně je lokalizován přebytečný elektron, tím více je stabilizován.

Zjistilo se, že vypočtené chemické posuny (δ) poněkud korelují s nejmenší hodnotou d(O3-Or) pro stejný počet vazeb H , zatímco přítomnost druhé vazby H zvyšuje δ kvůli zvýšenému stínícímu efektu. Na základě našich výsledků může být velká hodnota δ často dobrým ukazatelem SSHB, ale δ koreluje s kcat jen částečně. Tato korelace se snižuje zejména v případě velkého δ (>16 ppm) nebo malé absolutní hodnoty ΔrH (<0,5 Å), protože závislost kcat na δ byla zpochybněna (50).

Snižování aktivačních bariér v přítomnosti katalytických zbytků je dobře pochopitelné z MO analýzy (obr. 3). Nápadný rozdíl v energetických hladinách TS2 MO mezi a a g vyplývá z kvantové povahy přebytečné elektronové hustoty nahromaděné na substrátu díky deprotonizaci Asp-40. V tomto případě se jedná o tzv. Výsledná stabilizace získaná rozptýlením části elektronové hustoty do katalytických zbytků je způsobena již zmíněným principem neurčitosti, který je podobný tomu, co je pozorováno v případě přebytečného elektronu interagujícího s vodními klastry (51, 52), což je ve prospěch přiměřeně velkého prostoru dutiny. Přítomnost katalytických zbytků (které hrají roli nábojového pufru částečným přenosem elektronů ze substrátu na katalytické zbytky) tedy drasticky snižuje nárůst náboje na oxyaniontu. Této stabilizaci EI a TS v podstatě napomáhají SSHB. Tento účinek je vysoce zesílen v přítomnosti Asp-103 i Tyr-16/57. MO energie v případě g jsou tedy mnohem nižší než v případě a. Efekt dielektrického prostředí enzymu není tak drastický jako efekt katalytického rezidua zahrnující přenos elektronů. Částečné protonové přesuny a redistribuce náboje podporované SSHB jsou tedy více zodpovědné za snížení TS a EI než dielektrický efekt enzymu. V důsledku toho je katalytický účinek výsledkem příznivé kombinace zisků z neindukovaných elektrostatických energií a energií MO interakcí (polarizace, přenosu náboje a energie kovalentní vazby). Zatímco první je výsledkem částečných protonových přesunů v důsledku přítomnosti nabitých vazeb H (a tedy souvisí se silou SSHBs), druhý je výsledkem především elektronické delokalizace kvůli katalytickým zbytkům, které hrají roli nárazníku pro přebytečný elektron. Přírůstek energie MO interakce úzce souvisí s dodatečnou interakcí enzym-substrát podporovanou SSHB.

Stabilizační energii lze tedy představit jako součet zvýšené energie nabité H vazby (zahrnující iontové druhy) EIs/TSs vzhledem k normální H vazbě (mezi neutrálními partnery) ES a přírůstku energie MO interakce kvůli redistribuci náboje zahrnující disipaci elektronů do katalytických zbytků. Protože tyto dva energetické členy nejsou snadno oddělitelné, je obtížné odhadnout každý z nich. V případě d však tyto členy vyhodnotíme pomocí následující metody. Ze srovnání energií EI1 vzhledem k ES v nepřítomnosti a přítomnosti Tyr-16 (Y16) vyplývá, že stabilizační energie EI1 pomocí Y16 je 8,7 kcal/mol. Abychom prozkoumali příspěvek neindukované elektrostatické interakce (která nezahrnuje elektrostatický indukční účinek substrátu + Asp-40 (D40) na zbytek Y16) ke stabilizaci, provedli jsme výpočty ES a EI1 v případě, kdy je Y16 nahrazen duchovním zbytkem složeným pouze z nábojů jeho přirozeného vazebného orbitalu (NBO) (Y16q), které byly vypočteny pro jedinou molekulu Y16 v nepřítomnosti substrátu + D40. Pak je přírůstek energie neindukované elektrostatické interakce (nebo přírůstek elektrostatické energie řízený preorganizací) 4,4 kcal/mol, který je zodpovědný za zvýšenou pevnost vazby nabité vazby H (tj. samotné SSHB). Pak by rozdíl ve stabilizačních energiích mezi plným kvantovým účinkem pomocí Y16 a neindukovaným elektrostatickým účinkem pomocí Y16q (4,3 kcal/mol) měl pocházet z indukované elektrostatické interakční energie, kovalentní energie atd. Indukovaná elektrostatická interakce zahrnuje polarizační efekt a efekt přenosu náboje. Pro získání přírůstku indukované elektrostatické energie jsme nejprve získali atomové náboje Y16 (Y16qind), které zahrnují indukční efekt v přítomnosti substrátu + D40. Poté jsme provedli výpočty ES a EI1 v případě, kdy je Y16 nahrazen duchovním zbytkem (Y16qind) složeným pouze z jeho atomárních bodových nábojů. Vzhledem k tomu, že tato stabilizační energie je 8,2 kcal/mol, je indukovaný zisk elektrostatické energie z interakce mezi substrátem + D40 a Y16 3,8 kcal/mol. Zisk energie přenosem náboje a polarizací je tedy velký a srovnatelný s neindukovaným elektrostatickým ziskem energie. Reziduum Y16 hraje důležitou katalytickou roli nábojového pufru, který odebírá a udržuje velkou část přebytečného záporného náboje v substrátu, stejně jako odpovídající redistribuci elektronického náboje během reakce. Tato indukovaná elektrostatická energie vzniká z MO interakční energie kvantově mechanickou interakcí elektronického náboje mezi katalytickým zbytkem (Y16) a substrátem + D40 (tj. interakční energie řízená SSHB substrát-reziduum). Konečně zbývající příspěvek energie 0,5 (= 8,7 – 8,2) kcal/mol by mohl odpovídat převážně neelektrostatické kovalentní energii. Tato energie je poměrně malá, což dále potvrzuje naše MO analýza, že neelektrostatický překryv orbitalů v samotném SSHB není významný.

V enzymech zahrnujících dvoustupňový reakční mechanismus není substrát plně záporně nabitý, ale je částečně aniontový s rozptylem elektronů na katalytická rezidua. V tomto případě se tedy ukazuje, že přírůstek stabilizační energie (≈10 kcal/mol při EI1) řízený SSHB vzhledem k normální vazbě H není malý . Pokud se energie SSHB rozšíří tak, aby zahrnovala interakce mezi substrátem a reziduem v důsledku redistribuce náboje v substrátu i reziduu, jedná se o stabilizační energii, která je součtem energie SSHB řízené preorganizací a energie MO interakce řízené SSHB. Pokud však vezmeme v úvahu pouze sílu samotné SSHB, přírůstek vazebné energie se výrazně sníží (na ≈5 kcal/mol)

.