Isozym typu I

Jak je patrné z obr. 1, hexokináza slouží jako brána, kterou Glc vstupuje do alternativních metabolických drah. Nicméně je pravděpodobně bezpečné říci, že hexokináza je nejčastěji považována za glykolytický enzym a glykolytický metabolismus je obecně považován za cytoplazmatický proces. Bylo tedy pozoruhodné, že na rozdíl od jiných glykolytických enzymů byla aktivita hexokinázy (dnes známé jako izozym typu I) nalezena převážně v „partikulárních frakcích“ mozkových homogenátů (Crane a Sols,1953). Následné práce (Johnson, 1960; Rose a Warms, 1967; viz také Wilson, 1995) ukázaly, že partikulární hexokináza je spojena s mitochondriemi, a to konkrétně s vnější mitochondriální membránou (Rose a Warms, 1967; Kropp a Wilson, 1970). vazba je kriticky závislá na hydrofobní N-koncové sekvenci (Polakis a Wilson, 1985), která selektivně zaměřuje izozym typu I na mitochondrie (Gelb et al.), Sui a Wilson, 1997) a v průběhu vazby se vkládá do hydrofobního jádra vnější mitochondriální membrány (Xie a Wilson, 1988). Porin (nazývaný také `VDAC, zkratka pro `voltagedependent anion channel‘) tvoří kanál, kterým metabolity procházejí vnější mitochondriální membránou, a byl identifikován jako protein vnější mitochondriální membrány, který interaguje s hexokinázou(Felgner a kol., 1979;Lindén a kol., 1982;Fiek a kol., 1982). Navíc existují důkazy podporující názor, že k vazbě hexokinázy dochází přednostně na porin, který se nachází v kontaktních místech, tedy v oblastech, v nichž dochází k intimnímu kontaktu mezi vnitřní a vnější mitochondriální membránou(Dorbani et al., 1987;Kottke et al.,

Klasické studie Johnsona(1960) a Rose a Warmse(1967) byly brzy následovány zprávami o mitochondriálně vázané hexokináze z jiných normálních tkání, kromě mozku i z různých nádorových buněk (odkazy viz Wilson, 1985,1995). Potenciální fyziologický význam tohoto spojení „glykolytického“ enzymu s mitochondriemi, primárním místem oxidativního metabolismu, byl předmětem mnoha spekulací. Od počátku, zejména po zjištění, že „protein vázající hexokinázu“ vnější mitochondriální membrány je totožný s porinem, a tedy že hexokináza může být umístěna v blízkosti místa, kde ATP opouští mitochondrie (a ADP do nich opět vstupuje), spekulace byly z velké části zaměřeny na možnost, že by tato blízkost mohla podporovat intimní metabolickou interakci mezi intramitochondriální oxidativní fosforylací jako zdrojem substrátu ATP a fosforylací Glc mitochondriálně vázanou hexokinázou. To ostatně zvažovali i Rose a Warms(1967), ale jejich experimentální výsledky to nepotvrdily. Následné práce jiných autorů (odkazy viz Wilson,1985,1995), kteří použili mitochondriálně vázanou hexokinasu z různých zdrojů, však přinesly důkazy podporující názor, že mitochondriálně vázaná hexokinasa má „přednostní“ nebo „privilegovaný“ přístup k intramitochondriálně generovanému ATP.

Práce v naší laboratoři poskytla pevný základ pro názor, že hexokináza vázaná na aktivně fosforylující mozkové mitochondrie je skutečně těsně spojena s intramitochondriálním oddílem substrátu ATP, generovaného oxidativní fosforylací. Experimentální podpora tohoto závěru byla popsána v řadě publikací (BeltrandelRio aWilson, 1991,1992a,b;de Cerqueira Cesar a Wilson,1995,1998,2002;Hashimoto a Wilson, 2000). Úplný přehled těchto prací není v rámci tohoto kontextu možný, ale zdůrazníme některá hlavní zjištění, abychom ukázali rozmanitost experimentálních přístupů, které všechny vedly ke stejným závěrům a které byly v těchto studiích použity.

Počáteční studie (BeltrandelRio a Wilson,1991,1992a,b)byly provedeny pomocí spektrofotometrických metod, ve kterých byla produkce ATP různýmiintramitochondriálními procesy (oxidativní fosforylace, adenylátkinázová reakce, reakce kreatinkinázy) a fosforylace Glc hexokinázou spojena s produkcí NADPH, sledovanou při vlnové délce 340 nm, za použití příslušných spojovacích enzymů. Základní myšlenkou bylo, že porovnáním rychlosti Glcfosforylace s rychlostí produkce ATP z různých zdrojů lze odvodit relativní význam různých intramitochondriálních procesů generujících ATP jako zdroj substrátu ATP pro hexokinázu. Z toho vyplynulo, že když probíhá oxidativní fosforylace, není ani adenylátkináza, ani kreatinkináza významným zdrojem substrátovéhoATP. Navíc pouze část ATP vzniklého oxidativnífosforylací byla využita hexokinázou, což mělo za následek, že vextramitochondriálním prostředí se s pokračující oxidativní fosforylací nadále zvyšoval. Rychlost fosforylace Glc se v reakci na pokračující nárůst extramitochondriálního , nicméně trvale nezvyšovala, přestože byla srovnatelná s Km pro ATPzjištěnou při přidání extramitochondriálního ATP v nepřítomnosti oxidativní fosforylace, tj. hexokináza by nebyla „nasycena“ extramitochondriálním ATP jako substrátem (obr. 2). To silně naznačuje, že se jako substrát nepoužívá extramitochondriální ATP.

Další podporu pro to poskytly výsledky, jako jsou ty, které jsou uvedeny na obr. 3. Zde byla Glcfosforylace sledována po zahájení oxidativní fosforylace přidáním ADP, přičemž od počátku byly přítomny rostoucí koncentrace extramitochondriálního ATP. Jak se očekávalo podle klasické Michaelisovy-Mentenkinetiky, počáteční rychlost fosforylace Glc se zvyšovala s rostoucí extramitochondriální . Postupem času však bylo dosaženo ustáleného stavu rychlosti Glcfosforylace, který byl nezávislý na množství přítomného zbytkového extramitochondriálního ATP. Tyto výsledky byly interpretovány tak, že zatímco mitochondriálně vázaná hexokináza zpočátku využívalaextramitochondriální ATP, zahájení oxidativní fosforylace vedlo ke změně substrátové preference, přičemž hexokináza se stala závislou naintramitochondriálním oddílu ATP, v němž byla určena rychlost oxidativní fosforylace a který byl nezávislý na extramitochondriálním.

Ačkoli produkce ATP začala téměř okamžitě po zahájení oxidativní fosforylace přidáním ADP, došlo k výraznému zpoždění v zahájení fosforylace Glc mitochondriálně vázanou hexokinázou(obr. 3D) před dosažením ustáleného stavu, který přetrvával delší dobu. Toto počáteční období zpoždění bylo interpretováno jako doba potřebná k naplnění intramitochondriálního kompartmentu ATP, který vznikl oxidativní fosforylací a z něhož hexokináza vázaná na mitochondrie čerpala substrát ATP. Inhibice přenosu elektronů přidáním KCN vedla ke zjevnému uvolnění ATP, pravděpodobně z intramitochondriálního kompartmentu, a vlastnosti tohoto „kompartmentu“ (kinetika plnění, vazba na intramitochondriální produkci ATP atd.) byly v uspokojivé shodě s očekáváním založeným na této interpretaci (BeltrandelRio a Wilson,1991,1992a,b).Bohužel shoda s očekáváním není neomylným vodítkem k pravdivé skutečnosti a následně se ukázalo, že `zjevné uvolňování ATP‘ je artefakt (Laterveer et al.,1993).), jehož zdroj dosud není znám a který se nepodařilo reprodukovat v pozdějších pracích (deCerqueira Cesar a Wilson, 1998). I přes tento skličující a nepříjemný neúspěch byla základní koncepce spojení mitochondriálně vázanéhexokinázy s intramitochondriálním kompartmentem ATP podpořena dalšími důkazy a obstála v následných experimentálních testech.

Jako alternativa ke spektrofotometrickým postupům byla vyvinuta metoda dvojitého izotopového značení (deCerqueira Cesar a Wilson, 1995). Jako substrát pro hexokinázu byl použit 14C značený Glc a 32Pi dodával asubstrát pro syntézu ATP oxidativní fosforylací. Poměr32P/14C v Glc-6-P tak poskytl měřítko specifické aktivity substrátu ATP využívaného hexokinázou. Poměr32P/14C v Glc-6-P produkovaném mitochondriálně vázanou hexokinázou byl porovnán s poměrem produkovaným kvasinkovou hexokinázou, která se neváže na mitochondrie, a proto nutně využívá jako substrát extramitochondriálníATP. Kinetika značení poolů ATP používaných jako substrát mitochondriálně vázanou a kvasinkovou hexokinázou byla nápadně odlišná, což opět odpovídá názoru, že mitochondriálně vázaná hexokináza nevyužívá jako substrát extramitochondriální ATP, ale spíše čerpá z intramitochondriálního oddílu ATP, který vzniká oxidativní fosforylací.Například (obr. 4), přidání nadbytku 31Pi, čímž se výrazně snížila specifická aktivita 32P-ATP syntetizovaného oxidativní fosforylací, vedlo k rychlému poklesu poměru 32P/14C Glc-6-P produkovaného kvasinkovou hexokinázou za použití extramitochondriálního ATP. Naproti tomu došlo ke zpoždění a následně k poněkud pomalejšímu poklesu poměru32P/14C Glc-6-P produkovaného mitochondriálně vázanou hexokinázou. Poslední pozorování opět odpovídala názoru, že mitochondriální hexokináza využívala intramitochondriálníkompartment ATP, který nebyl volně vyrovnán s extramitochondriálnímATP.

Další experimentální přístup byl založen na porovnání hexokinázy vázané na mitochondrie a nevázaného kvasinkového enzymu (de CerqueiraCesar a Wilson, 1998,2002). Základní logika je znázorněna na obr. 5. Pevně stanovené množství mozkových mitochondrií s navázanou hexokinázou se smísí s rostoucím množstvím mitochondrií potkaních jater, které neobsahují navázanou hexokinázu. Jak mozkové, tak jaterní mitochondrie aktivně fosforylují, a proto se zvyšujícím se množstvím jaterních mitochondrií dochází ke zvyšování produkce ATP v systému. Koncepčně je koncentrace extramitochondriálníhoATP udržována v podnapilém stavu, tj. v ÅKm hexokinázy s extramitochondriálním ATP jako substrátem (při absenci oxidativní fosforylace). Pokud mitochondriálně vázaná hexokináza používá jako substrát extramitochondriální ATP, očekává se postupný nárůst rychlosti Glcfosforylace, jak se zvyšuje rychlost produkce ATP přidáním rostoucího množství jaterních mitochondrií. Ve skutečnosti se tak nestalo; rychlost fosforylace Glc hexokinázou vázanou na mitochondrie není zvýšením rychlosti produkce ATP významně ovlivněna (obr. 6). Očekávané zvýšení rychlosti fosforylace Glc je naopak patrné, pokud je mitochondriální hexokináza nahrazena ekvivalentním množstvím kvasinkové hexokinázy. Tyto výsledky jsou tedy opět v souladu s názorem, že mitochondriálně vázaná hexokináza využívá intramitochondriální ATP, který je vlastní mitochondriím, s nimiž je hexokináza spojena, ale je nezávislý na jakémkoli zvýšení extramitochondriálního ATP pocházejícího z jaterníchmitochondrií bez hexokinázy.

Nakonec další důkaz pro názor, že mitochondriálně vázanáhexokináza může rozlišovat mezi intra- a extramitochondriálním ATP, pochází ze zkoumání inhibice analogem Glc-6-P, 1,5-anhydroglucitol-6-P (1,5-AnG6P). V nepřítomnosti oxidativní fosforylace a s extramitochondriálním ATP jako substrátem je 1,5-AnG6P poměrně silný inhibitor, kompetitivní vůči ATP (obr. 7) (Hashimoto a Wilson, 2000). Naproti tomu s ATP dodávaným oxidativní fosforylací je 1,5-AnG6P jako inhibitor mnohem méně účinný. Je zřejmé, že ATP poskytovaný oxidativní fosforylací není ekvivalentní extramitochondriálnímu ATP. Podobné výsledky byly nedávno zaznamenány při použitímitochondriální hexokinázy z hovězího mozku(de Cerqueira a Wilson,2002)

Zkrátka, současný názor je, že v nepřítomnosti oxidativní fosforylace může mitochondriální hexokináza snadno využívat extramitochondriálníATP podle klasické Michaelis-Mentenovy kinetiky. Během aktivní oxidativní fosforylace je však mitochondriálně vázaný enzym spojen s intramitochondriálním bazénem ATP, přičemž rychlost Glcfosforylace úzce koreluje s rychlostí oxidativní fosforylace.Zdá se obtížné uvěřit, že v normální tkáni jsou mitochondrie někdy ve zcela nefosforylujícím stavu. Změny v rychlosti? Ano, samozřejmě, v závislosti na kolísání energetické potřeby. Ale skutečně nefosforylující? Pravděpodobně jen za těch nejhorších – a nakonec smrtelných – okolností. Z toho vyplývá, že za normálních podmínek je rychlost Glcfosforylace úzce koordinována s terminálními oxidačními fázemi Glcmetabolismu probíhajícími v mitochondriích a s tím související produkcí ATP oxidativní fosforylací. Jak již bylo uvedeno dříve (BeltrandelRio a Wilson,1992a), taková koordinace může zajistit zavedení Glc do glykolytického metabolismu rychlostí odpovídající terminálním oxidačním fázím, čímž se zabrání produkci neurotoxického laktátu (Marie a Bralet, 1991) a zároveň se zajistí čistý tok přes cytoplazmatickou a mitochondriální část dráhy rychlostí odpovídající energetickým požadavkům (obr. 8).

Není známo, jak je tato pozoruhodná změna substrátové specifity (intramitochondriální versus extramitochondriální ATP) vyvolána oxidační fosforylací, ale je zřejmé, že konformace enzymu vázaného na mitochondrie je ovlivněna potenciálem mitochondriální membrány, jakož i dalšími faktory souvisejícími s funkcí mitochondrií, což naznačuje těsnou interakci mezi vnitřní (přes kterou existuje membránový potenciál) a vnější (na kterou je hexokináza vázána) membránou této organely (Hashimoto a Wilson, 2000).Konformační změny postihující oblasti molekuly podílející se na vazbě substrátu ATP byly již dříve postulovány(de Cerquiera a Wilson,1998) jako příčina změn substrátové specifity.

.