Study Design

Švédský program screeningu rakoviny děložního čípku vyzývá ženy ve věku 23 až 50 let ke screeningu rakoviny děložního čípku v tříletých intervalech a ženy ve věku 51 až 60 let ke screeningu v pětiletých intervalech. Ženy pozvané ke screeningu jsou vybírány z populačního registru, v němž jsou uvedeny všechny ženy ve Švédsku; ženy, u nichž je v registrech cytologických vyšetření zaznamenáno, že jim byl nedávno proveden stěr z děložního čípku mimo screeningový program, nejsou k účasti ve screeningovém programu zvány.

Všechny ženy ve věku 32 až 38 let, které se zúčastnily screeningového programu od května 1997 do listopadu 2000 v pěti švédských městech (Göteborg, Malmö, Uppsala, Umeå a Stockholm), byly způsobilé; jediným vylučovacím kritériem bylo nesouhlas s účastí ve studii. Počet žen, které odmítly účast ve studii, není znám, ale při průzkumech ve screeningových centrech bylo zjištěno velmi málo žen, které s účastí nesouhlasily.

Obrázek 1.Obrázek 1. Zapojení do studie a její výsledky.

Seznamy žen, které byly pozitivní na HPV, byly porovnány se seznamy v cytologických registrech a ženám, u nichž bylo zjištěno, že již byly odeslány kvůli abnormálním stěrům, nemělo být nabídnuto druhé vyšetření HPV nebo cytologické vyšetření. K porušení protokolu mohlo dojít v důsledku lidské chyby nebo proto, že registry v té době obsahovaly předběžné nebo neúplné údaje. Nevyřízené se týká testů, které ještě nebyly provedeny, nebo kolposkopií, které ještě nebyly provedeny v době ukončení sledování této studie. Studie byla odslepena 4 měsíce po dokončení prvního kola kolposkopií, kdy již 22 z 80 žen v intervenční skupině a 24 ze 74 žen v kontrolní skupině podstoupilo následný HPV test nebo Pap stěr. HPV označuje lidský papilomavirus.

Celkem 12 527 souhlasících žen bylo náhodně zařazeno v poměru 1:1 do intervenční skupiny (Pap test plus test na infekci HPV; 6257 žen) nebo kontrolní skupiny (samotný Pap test; 6270 žen) (obrázek 1). Randomizaci provedl nezávislý institut (Stockholmský onkologický registr) pomocí počítačem vygenerovaných náhodných čísel. Ženy ani klinický personál nevěděli o zařazení žen do testu a laboranti, kteří prováděli HPV testy, neměli o ženách žádné osobní informace. Seznamy s kódovými čísly určujícími, které vzorky mají být testovány, byly virové laboratoři vydány až poté, co vzorky dorazily. Protože podíl žen s pozitivním HPV testem, u nichž byla zjištěna cervikální intraepiteliální neoplazie 2. nebo 3. stupně nebo rakovina, byl mnohem větší, než se očekávalo, rozhodl řídící výbor přerušit zaslepování studie a informovat ženy o výsledcích jejich HPV testů 11. srpna 2003 (3 roky po ukončení zařazení do studie a 4 měsíce po ukončení prvního kola kolposkopie v obou skupinách). Relativní počty žen v intervenční a kontrolní skupině, které podstoupily kontrolní HPV test, se po přerušení zaslepení významně nezměnily: dokud byla studie stále zaslepená, podstoupilo kontrolní test 22 žen v intervenční skupině a 24 žen v kontrolní skupině; po přerušení zaslepení podstoupilo kontrolní test 58 žen v intervenční skupině a 50 žen v kontrolní skupině.

Exterocervikální a ektocervikální vzorky byly odebrány cytologickým kartáčkem. Po přípravě konvenčního stěru byl kartáček promíchán v 1 ml sterilního 0,9% chloridu sodného, aby se uvolnily zbývající buňky pro analýzu HPV DNA. Vzorky byly transportovány zmrazené při -20 °C k vyšetření na přítomnost HPV DNA.

Podoba zákroku provedeného v důsledku základního cytologického vyšetření vycházela z regionální rutinní praxe. Ve Stockholmu byly všechny ženy s abnormálním Papovým stěrem (definovaným jako stěr s atypickými dlaždicovými buňkami neurčitého významu nebo závažnější cytologickou diagnózou ) okamžitě odeslány ke kolposkopii, zatímco v ostatních městech přicházelo v úvahu opakování Papova stěru v případě ASCUS nebo cervikální intraepiteliální neoplazie 1. stupně. Koilocytóza v normálním stěru byla považována za abnormální cytologický nález pouze ve dvou městech (Umeå a Göteborg). Švédsko používá starou americkou cytologickou nomenklaturu21 , v níž může být diagnóza koilocytózy stanovena jako doplněk k jakékoli jiné diagnóze. Pouze 0,2 % stěrů bylo hlášeno jako normální s koilocytózou jako doplňkovou diagnózou. Je tedy nepravděpodobné, že by regionální rozdíly v postupech odesílání měly vliv na výsledky studie.

V intervenční skupině bylo ženám s pozitivním HPV testem a bez záznamu o odeslání kvůli abnormálnímu výsledku Pap testu nabídnuto druhé kolo HPV a Pap testu nejméně o 12 měsíců později (obr. 1). Po tomto druhém kole testů byla ženám, které byly nadále infikovány stejným vysoce rizikovým typem HPV, nabídnuta kolposkopie. Aby se zabránilo zkreslení zjištění, byl podobnému počtu náhodně vybraných žen z kontrolní skupiny rovněž nabídnut druhý Pap test a kolposkopie. Ženy ani lékaři nebyli informováni o výsledcích HPV testu a stavu randomizace žen.

Vzorky cervikální biopsie byly odebrány ze všech lézí, které po ošetření kyselinou octovou zbělely, a z lézí, které nebyly obarveny Lugolovým roztokem jódu. Pokud takové léze nebyly pozorovány, byly odebrány dva vzorky v poloze 12 hodin a 6 hodin na ektocervixu, v blízkosti skvamokolumnární buněčné junkce.22 Kromě těchto vzorků z ektocervixu byl u všech žen získán vzorek z endocervikálních buněk.

Protokol vyžadoval kromě dodržování běžné klinické praxe v případě abnormálních cytologických, kolposkopických nebo histopatologických nálezů každoroční stěry Pap a HPV testy, v případě přetrvávající vysoce rizikové HPV infekce kolposkopii. Epiteliální neoplazie děložního hrdla vysokého stupně (stupeň 2 nebo 3) se vždy léčí konizací, obvykle excizí kličkou. Ženy byly sledovány pomocí osobních identifikačních čísel a propojení regionálních cytologických, regionálních patologických a národních cytologických registrů. Tyto registry obsahují údaje o všech Papových stěrech a cervikálních biopsiích provedených ve Švédsku, nejen o těch, které byly provedeny v rámci screeningového programu. Datum posledního sledování bylo 31. srpna 2005 pro Stockholm a Uppsalu a 31. prosince 2004 pro ostatní města.

Histologické vzorky s abnormální diagnózou a všechny bioptické vzorky získané během kolposkopie ve studii byly znovu vyhodnoceny odborným patologem, který nevěděl o randomizačním statusu subjektu. Pokud se druhá diagnóza lišila od původní diagnózy o více než jeden stupeň závažnosti, posoudil diagnózu jiný odborný patolog, který neznal randomizační status subjektu. Pokud se vzorek nepodařilo dohledat, byla použita původní diagnóza. Přehodnocení bylo základem pro 218 z 258 diagnóz cervikální intraepiteliální neoplazie nebo karcinomu 2. nebo 3. stupně.

Primárním výsledkem studie byl výskyt lézí cervikální intraepiteliální neoplazie nebo karcinomu 2. nebo 3. stupně (které zahrnují invazivní karcinomy a adenokarcinomy in situ) zjištěných screeningem, který proběhl po screeningu při zařazení do studie. Sekundárními výsledky byla incidence lézí nebo karcinomů 2. nebo 3. stupně při vstupním screeningu a výsledky stratifikované podle lézí pouze 2. stupně a lézí nebo karcinomů 3. stupně jako koncových bodů. Studie byla schválena etickou komisí Karolinska Institute, která stanovila postup souhlasu, v němž všichni účastníci po obdržení písemných informací poskytli ústní souhlas.

Testování na přítomnost HPV DNA

Testování na přítomnost HPV DNA bylo provedeno pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) – enzymového imunologického testu s použitím obecných primerů GP5+ a GP6+, který detekuje 14 vysoce rizikových typů HPV (typy 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68).23,24 K testování kvality DNA vzorku byla použita amplifikace lidského β-globinu.24 PCR pozitivní vzorky byly typizovány pomocí reverzní dot blot hybridizace s rekombinantními HPV plazmidy specifickými pro daný typ.25 Pokud byl výsledek reverzní dot blot hybridizace negativní, byly amplimery klonovány a sekvenovány. Pouze PCR pozitivní vzorky potvrzené reverzní dot blot hybridizací nebo sekvenováním byly klasifikovány jako HPV pozitivní.

Statistická analýza

Do analýz byly zahrnuty pouze ženy, které po základní návštěvě podstoupily alespoň jeden Pap stěr nebo alespoň jednu biopsii. U 1568 žen nebyly k dispozici žádné kontrolní vzorky; podle údajů z populačního registru 8 z těchto žen zemřelo a 82 opustilo zemi. Průměrná doba sledování byla 4,1 roku (rozmezí <0,1 až 7,7) a mezi oběma skupinami se významně nelišila.

Údaje všech žen byly cenzurovány v den jejich posledního vyšetření s výjimkou žen, jejichž údaje byly cenzurovány v den diagnózy léze cervikální intraepiteliální neoplazie 2. nebo 3. stupně nebo karcinomu. Pokud byla jako koncový bod ve stratifikované analýze použita léze 3. stupně nebo rakovina, byly údaje cenzurovány k datu diagnózy bez ohledu na předchozí diagnózu léze 2. stupně.

Léze byly připsány screeningu při zařazení a souvisejícímu sledování (prevalenčnímu screeningu), pokud Papův stěr při zařazení vyvolal okamžité odeslání ke kolposkopii podle regionální klinické praxe; pokud Papův stěr při zařazení vedl ke sledování s dalšími Papovými stěry; pokud byla provedena biopsie děložního hrdla v intervalech nepřesahujících 18 měsíců; nebo pokud byla léze nalezena v důsledku protokolárních postupů u ženy s HPV pozitivním testem (intervenční skupina) nebo v důsledku odpovídajících, náhodně přiřazených postupů v podskupině kontrolní skupiny, která byla sledována za účelem kontroly verifikačního zkreslení. Za následný (incidenční) screening byly považovány výsledky ze screeningových kol, která se měla uskutečnit o 3 roky později, a ze všech ostatních Pap stěrů, které neodpovídaly těmto definicím (tj. byly provedeny během screeningu mimo studii).

Výsledky byly analyzovány po ukončení screeningového kola v dalším tříletém intervalu. Studie měla sílu detekovat ochranu proti lézi cervikální intraepiteliální neoplazie 2. nebo 3. stupně nebo rakovině děložního hrdla při incidenčním screeningu alespoň 50 % při konvenční hladině významnosti (α=0,05) a síle (1-β=0.80) za předpokladu, že tříletá kumulativní incidence cervikální intraepiteliální neoplazie 2. nebo 3. stupně nebo rakoviny v této věkové skupině je 1,0 %.

Relativní míry a 95% intervaly spolehlivosti byly vypočteny pomocí Poissonovy regresní analýzy. Vzhledem k tomu, že primárním záměrem studie bylo reflektovat screeningový program v reálném životě, porušení protokolu nebylo z analýzy vyloučeno a všechny analýzy jsou uváděny jako analýzy záměru léčby (intention-to-treat).