Materiály a metody

Sběr vzorků

Účastníci starší 18 let byli vyzváni k účasti ve studii prostřednictvím e-mailových oznámení a inzerátů umístěných na nástěnkách na University of British Columbia, Vancouver BC. Účastníci byli požádáni, aby poskytli vzorky pomocí bukálních tamponů se suchým zámkem (Puritan PurFlock, Fisher Scientific, Waltham MA) a bukálních tamponů s houbičkou (Oragene ORAcollect, DNA Genotek, Ottawa, ON) podle vlastních pokynů; pořadí, v němž byly tyto vzorky poskytnuty, bylo náhodně určeno počítačem. Během odběru vzorků byl přítomen výzkumný asistent, který odpovídal na otázky účastníků týkající se pokynů k odběru vzorků. Všechny vzorky byly uchovávány při pokojové teplotě. Farmakogenetické zprávy nebyly účastníkům předány, protože to nespadalo do rozsahu této studie.

Extrakce DNA

DNA byla extrahována pomocí soupravy Ambion MagMAX pro extrakci DNA pomocí kuliček (Applied Biosystems, Foster City, CA) podle pokynů výrobce. DNA byla extrahována 3 dny po odběru vzorku a eluována v 60 µl. Množství a kvalita DNA byly hodnoceny pomocí fluorescenčního testu Qubit 2.0 (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). Čistota vzorků byla stanovena podle hodnot optické hustoty A260/280 (ODA260/280) pomocí spektrofotometru NanoVue.

Genotypizace

Genotypizace byla provedena na přístroji QuantStudio 12K Flex quantitative polymerase chain reaction (qPCR) (LifeTechnologies, Carlsbad, CA) na testech validovaných výrobcem (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). Obsah testů zahrnoval 28 SNP ovlivňujících reakci na léčivo na platformě OpenArray (viz doplňkový soubor 2) a test CYP2D6 CNV TaqMan (Assay ID: Hs_00010001_cn). Pro ověření testů bylo genotypováno 44 kontrolních vzorků DNA z Národního ústavu všeobecných lékařských věd (NIGMS), úložiště lidských genetických buněk v Coriell Institute for Medical Research. Byla potvrzena shoda volání s očekávaným genotypem. Výsledky byly navíc ověřeny Sangerovým sekvenováním kontrolní DNA. Pro každý běh byly vzorky účastníků provedeny ve dvou opakováních na OpenArray a ve čtyřech opakováních na testu CNV spolu se vzorky DNA Corriell použitými jako pozitivní kontroly a kontroly bez šablony (NTC).

Statistická analýza

Software TaqMan Genotyper v1.3.1 (Applied Biosystems) byl použit ke stanovení míry volání genotypů SNP na OpenArray. Míra přiřazení genotypů byla vypočtena pro každou analýzu OpenArray vydělením celkového počtu úspěšně přiřazených genotypů celkovým počtem pokusů o přiřazení genotypů.

Pro analýzu CNV TaqMan byl použit software CopyCaller v2.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) k přiřazení volání počtu kopií CYP2D6 a skóre spolehlivosti CNV. Vzorkům DNA byl přiřazen diploidní počet kopií divokého typu a odchylky v počtu kopií (delece nebo duplikace) byly zařazeny do skupin 2N a CNV. Pro výsledky genotypizace SNP a CNV byla stanovena 95% míra vyvolání genotypu a 95% skóre spolehlivosti. Pro stanovení významného rozdílu mezi výtěžností, čistotou a mírou volání DNA z různých typů DNA v párech byl vypočten dvouvýběrový Studentův t-test za předpokladu nerovných rozptylů. Pro výpočet konkordance byla porovnána přiřazení genotypů vytvořená z jednotlivých typů vzorků DNA (s houbičkou vs. se suchým zámkem) od téhož účastníka.

Výsledky

Třicet jedna účastníků bylo rekrutováno a byly jim odebrány tampony s houbičkou a tampony se suchým zámkem. Účastníci považovali pokyny pro odběr s vlastním vedením za jednoduché a snadno dodržitelné pro oba typy tamponů. Účastníci vznesli dotazy týkající se potřebného tlaku pro potírání tamponů a správného umístění tamponů v ústech. Připomínky účastníků k oběma tamponům byly podobné, někteří dávali přednost tamponům s houbičkou a jiní tamponům se suchým zámkem; nedošlo ke shodě názorů.

Byl zjištěn významný rozdíl v průměrné výtěžnosti DNA získané pomocí tamponů se suchým zámkem oproti tamponům s houbičkou (0,26 ± 0,34 µg vs. 1,91 ± 1,44 µg p = 4,4 × 10-7; tabulka 1). Průměrná čistota DNA ve všech typech odběrů byla v přijatelném rozmezí pro čistou DNA (průměr (SD)) 1,72(0,78) a 1,85(0,39) pro suché tampony a tampony s houbičkou.

Ve třech vzorcích odebraných z tamponů s houbičkou byly zjištěny nízké koncentrace DNA (< 5 ng/µl). Tyto tři vzorky měly 100% míru genotypového volání na OpenArray a 100% skóre spolehlivosti CNV (obr. 1). Naopak jeden ze vzorků, který měl koncentraci DNA 79 ng/µl, měl nejnižší míru volání OpenArray (18 %). Nejvyšší míra vyvolání na OpenArray (> 95 %) u stěrů se suchým zámkem byla zaznamenána u sedmi vzorků s koncentrací v rozmezí 1,2 až 8,9 ng/µl (obr. 1a). Nejvyšší spolehlivost volání CNV (> 95 %) byla pozorována u vzorků s koncentrací v rozmezí od 1,0 do 24,4 ng/µl (obr. 1b).

Pro všechny testy na OpenArray, vzorků DNA odebraných z tamponů s houbičkou došlo k celkově vyššímu počtu genotypových volání (97 %) ve srovnání s tampony se suchým zámkem (54 %) (obr. 2). S přidaným krokem 0,5násobného ředění extrahované DNA měly tampony s houbičkou konzistentní míru genotypizace > 95 %. U 29(93,5 %) účastníků se u vzorku s DNA z tamponů odebraných houbičkou a u 4(12,9 %) účastníků s DNA ze suchého tamponu míra genotypizace > 95 % lišila podle jednotlivce. Byla pozorována 94% shoda úspěšně provedených genotypových testů mezi stěry odebranými z houby a stěry odebranými za sucha

Volání čísla kopie pro CYP2D6 byla přiřazena 2(6,5 %) vzorkům z výtěrů odebraných houbou s celkovým skóre spolehlivosti 0,99. Pro srovnání, 8(25,8 %) vzorků ze suchých tamponů bylo přiřazeno volání počtu kopií s celkovým skóre spolehlivosti 0,91 (viz doplňkový soubor 3).

Diskuse

Účelem tohoto výzkumu je pomoci vyšetřovatelům a společnostem určit optimální metodu odběru, která poskytuje vysoce kvalitní DNA pro genotypizaci. Tato studie poskytuje nové informace o kvalitě DNA u dvou typů výtěrů, která byla vysoká (definovaná jako ODA260/A280 1,8), ačkoli existoval významný rozdíl ve výtěžnosti DNA (p-hodnota = 4,4-7). Na platformě OpenArray měly tampony s houbičkou nejvyšší celkovou míru genotypizace (97 % vs. 54 %) a nejvyšší skóre spolehlivosti pro CYP2D6 CNV TaqMan Assay (0,99 vs. 0,91). Má se za to, že > 95% míra vyvolání genotypizace SNP odráží přijatelnou kvalitu údajů a skóre spolehlivosti CNV 99 % se považuje za vysokou kvalitu .

Jeden vzorek DNA izolovaný z tamponu s houbovou špičkou měl míru vyvolání nižší než 95 %. V běžné laboratorní praxi by vzorky s nízkou mírou vyvolání byly znovu odebrány z důvodu neúplných výsledků pro hlášení pacientů. Vynechání tohoto vzorku zvýšilo celkovou míru genotypizace na 99,5 % pro tampony s houbičkou.

Výsledky CNV u CYP2D6 ukázaly nárůst přiřazení CNV u DNA odebrané z tamponů se suchým zámkem 8(25,8 %) ve srovnání s tampony s houbičkou 2(6,5 %). Vyšší počet přiřazení CNV koreloval s nižším skóre spolehlivosti. Většina účastníků 30(97 %) byla schopna odebrat vzorky, které vedly k vysokému počtu genotypovacích přiřazení pro tampony s houbičkou, zatímco pouze několik jedinců 4(13 %) bylo schopno odebrat vzorky s vysokým počtem přiřazení pro oba typy tamponů. Závěrem lze říci, že tampony s houbičkou byly pro pacienty přijatelné a poskytovaly DNA dobré kvality s dostatečnou výtěžností pro farmakogenetické testování založené na qPCR.

.