Matematická charakterizace dynamiky TA

Dynamika TA je dána tím, jak jsou jeho komponenty prostorově a časově uspořádány na promotoru. Protože TA může nabývat mnoha různých konfiguračních stavů a vývoj stavu je v podstatě stochastický, zahrnuje mnoho molekul a složité interakce, využíváme ke zkoumání dynamiky TA teorie statistiky a pravděpodobnosti. Pro zjednodušení předpokládáme, že koncentrace druhů spojených s transkripcí, jako jsou GTF, zůstávají v okolí modelového genu konstantní a molekulární interakce zahrnující promotor jsou v dynamické rovnováze. Termín „dynamická rovnováha“ neznamená, že všechny molekulární interakce jsou reverzibilní; spíše jen vyžaduje, aby TA po určité době obnovil svůj současný stav. Modelový gen a všechny druhy kolem něj tvoří systém. Z výše uvedených předpokladů vyplývá, že takový systém je v ustáleném stavu. Uvažujme statistický soubor sestávající z velkého počtu takových v podstatě identických systémů, přičemž každý z nich se vyvíjí nezávisle. Počet těchto systémů je dostatečně velký, aby tento soubor mohl pokrýt všechny možné konfigurační stavy TA. To znamená, že každý stav, kterým prochází jednotlivý gen, mapuje stavy ostatních genů v souboru a podíl genů ve zvláštním stavu X (např. genů s enhancery vázanými aktivátory), P(X), zůstává v čase konstantní. Ekvivalentně, pokud je jednotlivý gen pozorován v libovolném čase, pravděpodobnost, že se gen nachází ve stavu X, je rovněž P(X). V tomto smyslu je to, v jakém stavu se jednotlivý gen nachází, náhodná událost.

Pro minimální model (obr. 1a) definujeme všechny konfigurační stavy TA jako univerzální množinu Ω a různé stavy se stejnými klíčovými vlastnostmi jako následující podmnožiny, respektive (obr. 1b). A označuje, že enhancer je vázán aktivátorem. S označuje, že jádro promotoru je vázáno proteiny SCF. M označuje, že nascentní mRNA je ve fázi gestace (včetně procesu od vzniku PIC po únik Pol II do elongace). J označuje, že aktivátor vázaný na enhancer je koncipován na SCF, PIC nebo OPC prostřednictvím mediátoru. Protože iniciace eukaryotické transkripce vyžaduje přítomnost SCF na jádru promotoru4,12, M⊂S. V souladu s definicemi je J⊂AS. V souboru MJ jsou M a A souběžné, tj. aktivátory vázané na enhancer mohou přímo ovlivňovat působení Pol II prostřednictvím mediátoru. Transkripční iniciaci pod přímou regulací aktivátorů tedy popisuje množina MJ, zatímco základní, na aktivátorech nezávislá transkripční iniciace je zahrnuta v množině M-J. Pravděpodobnost vzniku nascentní mRNA v těhotenství, tj. pravděpodobnost, že vznikne mRNA, je

kde q je konstanta představující bazální transkripční iniciaci a Aj je podmnožina A (podrobnosti viz S1 v Doplňkových informacích). V Aj jsou aktivátory vázané na enhancer povinny kontaktovat mediátor připojený k SCF, PIC nebo OPC. Rovnice (1) charakterizuje vztah mezi produkcí mRNA a dynamickými vlastnostmi TA.

Kódování koncentrace transkripčních aktivátorů

V závislosti na odlišné architektuře promotorového chromatinu v různých transkripčních fázích mohou aktivátory vázané na enhancer plnit různé funkce, například podporovat acetylaci histonů a rekrutovat GTF4,5,15 . Konkrétně sada Aj zahrnuje aktivátory vázané na enhancer, které jsou zodpovědné za obsluhu základního transkripčního aparátu a řízení transkripční iniciace. Aktivita těchto aktivátorů navíc souvisí i s kódováním jaderné koncentrace aktivátorů, neboť je jediným faktorem v rovnici (1) závislým na koncentraci aktivátorů. Zde zkoumáme dynamiku těchto aktivátorů.

Aktivátory se rychle pohybují v jádře a pravděpodobnost, že dosáhnou enhanceru, je úměrná jejich jadernému množství9. Uvažujme časový úsek, během něhož se aktivátory zapojené do sady Aj vážou na enhancer a poté od něj odcházejí po dobu m (m = 1, 2, 3, …) cyklů. Definujeme časovou míru obsazení RTOR těchto aktivátorů jako , kde a označují dobu navázání a odvázání j-tého cyklu. Pro pevný počet na aktivátorů v jádře máme

kde aon a aoff jsou funkce náchylnosti k navázání, resp. odvázání (podrobnosti viz S2 v Doplňkových informacích). aon je funkce na, zatímco aoff je na na nezávislá. Z rovnice (2) vyplývá, že s rostoucím m konverguje k deterministické hodnotě, která je monotónně rostoucí funkcí na (obr. 1c-d a obr. S1; tato vlastnost je obecná a lze ji aplikovat na případy, kdy je počet kognitivních vazebných míst na enhanceru větší než jedna (viz rovnice S13-S18)). Tato konvergence znamená, že i časově proměnlivá koncentrace aktivátorů může být kódována RTOR za předpokladu, že aktivátory cyklicky přibývají a ubývají na enhanceru dostatečně často v časovém okně, přičemž jejich koncentrace se téměř nemění. Ve skutečnosti existují aktivní disociační mechanismy, které zaručují rychlé cyklování aktivátorů9,19,20,21,22. Doba vazby byla odhadnuta v rozmezí sekund až desítek sekund9,10 . Na endogenním genu CUP1 bylo navíc prokázáno, že takové rychlé cyklování je funkční10. Pravděpodobně RTOR kóduje koncentraci transkripčních aktivátorů. Na druhou stranu během časového úseku, kdy aktivátory cyklicky zapínají a vypínají enhancer po dobu mkrát, je pravděpodobnost, že se enhancer nachází vázaný takovým aktivátorem, . Protože průměr v celém souboru je také f(na), máme

Omezující podmínky zajišťující spolehlivou transkripční odezvu

Vzhledem ke stochasticitě výskytu transkripčních událostí vyžaduje dosažení spolehlivé transkripční odezvy, aby kód RTOR, který včas reprezentuje koncentraci aktivátorů, byl s vysokou věrností převeden na množství transkriptů. V ideálním případě, kdyby se P(S), a rovnaly 1, by bylo dosaženo přesného přenosu informace. V následujícím textu uvádíme podmínky, za kterých mohou být tyto tři faktory dostatečně velké, aby zajistily spolehlivou transkripční odezvu v přítomnosti náhodných fluktuací (obr. S2 a S3 poskytují intuitivní vysvětlení této podkapitoly).

Z rovnice (3) vyplývá, že koncentrace aktivátorů nemůže být dostatečně zakódována bez setrvání SCF na promotoru. SCF by se tedy měl rychle shromažďovat, pokud to architektura chromatinu umožňuje, a měl by být mnohem stabilnější než aktivátory vázané na enhancer (podmínka I). Taková stabilita SCF byla experimentálně pozorována a doba vazby TBP (TATA-vazebný protein, základní složka SCF) na promotor může být v lidských buňkách až 20 min11. Pro je Aj předpokladem vzniku J. Protože RTOR je určován jednotlivými krátkými vazebnými časy aktivátorů, měl by J nastat bezprostředně po vzniku Aj (obr. S3). V opačném případě se informace o RTOR do značné míry ztrácí nebo je dokonce falešně využita k usměrnění transkripční iniciace (všimněte si, že J je předpokladem M). Proto by pro správný přenos kódu RTOR měl Mediátor působit tak, že počká na navázání cyklických aktivátorů a předá informaci prostřednictvím alosterie23,24,25 (podmínka II). Je tomu tak proto, že jiné druhy molekulárních interakcí, jako jsou volné srážky, nemohou přesně předat informaci o době vazby aktivátorů. Takový alosterismus mediátoru je podpořen předchozí prací26. určuje, jak je informace o RTOR zděděná J převedena na orientační množství transkriptů. Protože RTOR závisí na přerušované vazbě aktivátorů, velký vyžaduje, aby během krátké doby vazby byly transkripty produkovány poměrně rychle (obr. S2) (podmínka III). Tuto vlastnost ověřují i výpočetní odhady experimentálních dat (viz S3 v Doplňkových informacích). Všechny tři podmínky tedy mohou být přirozeně splněny.

Dynamický mechanismus transkripce regulované aktivátorem

Výše uvedené tři omezující podmínky společně určují, jak TA funguje. Opakovaně vzniká stav, kdy se mezi mediátorem a enhancerem vytvoří relativně stabilní prostor podobný svorce (obr. 2; podle podmínek I a II). Protože se experimentálně ukázalo, že SCF není příliš stabilní11 , je tento prostor dočasně vytvořen. Prostor podobný svorce přitahuje volné aktivátory a poté je rychle odlupuje, přičemž o RTOR rozhoduje koncentrace aktivátorů (podle rovnic (2-3)). Jakmile se do tohoto prostoru dostane jedna molekula aktivátoru, vznikne v mediátoru alosterie, což má za následek usnadnění okolností pro GTF a další příbuzné proteiny, aby mohly plnit své funkce. V důsledku toho může Pol II velmi rychle iniciovat/reiniciovat transkripci (podle podmínek II a III), přičemž množství transkriptů řídí RTOR.

Tento mechanismus naznačuje, že molekulární interakce zahrnující promotor se řídí následujícími elegantními dynamickými principy. Zatímco prostor podobný svorce se vytváří dočasně, je mnohem stabilnější než aktivátory v něm usazené. Aktivátory mohou mnohokrát cyklicky vstupovat do prostoru a vystupovat z něj i během krátkých epizod, kdy se jejich koncentrace téměř nemění; koncentraci aktivátorů lze tedy včas reprezentovat pomocí RTOR. Protože mediátor přenáší informaci prostřednictvím alostery a rychlost transkripční reiniciace je mnohem větší než rychlost cyklování aktivátorů, kód RTOR se účinně využívá k řízení syntézy mRNA. Jedním slovem, prostor podobný svorkám je strukturním základem pro spolehlivé transkripční odpovědi. Stochastická povaha molekulárních interakcí se spíše než jako překážka plně využívá ke spolehlivému vyvolání transkripce; to do značné míry závisí na různé míře stability složek TA, která zahrnuje několik řádů. Výše uvedené argumenty jsou podpořeny experimentálními daty a typická časová měřítka jsou následující: poločas života prostoru podobného svorce je asi 5 min11 , doba obsazení aktivátorů v prostoru se pohybuje v rozmezí sekund až desítek sekund10 , k alosteraci obvykle dochází v čase od milisekund do maximálně 1 sekundy23,24,25 a k opětovné iniciaci transkriptu stačí několik sekund (viz S3 doplňkových informací).

Ověření mechanismu pomocí numerických simulací

Pro další ověření navrženého dynamického mechanismu jsme sestavili zjednodušený stochastický model genové transkripce s fyziologicky realistickými parametry (podrobnosti viz obr. S4 a S4 v Doplňkových informacích). Tento model zobrazuje klíčové stavové přechody TA a také jednoduše popisuje související dynamiku chromatinu, čímž je schopen charakterizovat transkripční odpověď na transkripční aktivátory. V následujícím textu „vstup“ a „výstup“ označují jadernou koncentraci aktivátorů a množství genových produktů, mRNA, resp. proteinu.

Nejprve zkoumáme časový vývoj počtu buněčných mRNA při konstantních vstupních hladinách (obr. 3a). Je pozoruhodné, že mRNA jsou produkovány burstovým způsobem, což je v souladu s převládajícím názorem14,27,28,29,30,31,32 . U nízkoúrovňových vstupů je jedna alela transkribována, zatímco druhá je v diploidní buňce němá, a je tedy patrný jev burstingu. U vstupů vysoké úrovně však obě alely praskají často, takže součet se stává téměř konstantním. To naznačuje, že fenotyp přetrvávajících zvýšených transkripčních odpovědí lze pozorovat při vysokých úrovních vstupu14.

Nedávná experimentální analýza vyloučila možnost, že by prostředí chromatinu hrálo hlavní roli při utváření transkripčního burstingu32. Zde prokazujeme, že burst transkriptů vzniká z přetrvávající reiniciace Pol II, když je prostor podobný svorce obsazen aktivátory (obr. 4). To znamená, že samotná iniciace mRNA je burst-like. Burst není pouhým šumem, ale přímým projevem kódu RTOR, který představuje koncentraci aktivátorů a řídí produkci mRNA.

Druhé, zkoumáme průměrný vztah vstupu a výstupu transkripční odezvy. Průměrný výstup se podobá Hillově funkci vstupu, která se široce používá v systémové biologii k modelování genové exprese3,33,34 (obr. 3b). Křivka směrodatné odchylky SDout výstupu v závislosti na vstupu má přibližně tvar zvonu (obr. 3c). Intenzita vlastního šumu, definovaná jako poměr SDout k průměrnému výstupu35 , je nepřímo úměrná vstupu (vložený obrázek na obr. 3b). Výše uvedené vlastnosti jsou navíc necitlivé na mírné výkyvy na vstupu (tj. vnější šum) (obr. S5), což naznačuje robustnost transkripční odezvy na šum. Všechny tyto výsledky jsou v dobré shodě s experimentálními měřeními u Saccharomyces cerevisiae36 i embryí Drosophily37. Zejména levá strana křivky SDout je nižší než její pravá strana; tento rys je téměř kvantitativně v souladu s experimentálními údaji37 (další diskuse viz S5 v doplňkových informacích). Naopak odchylky od výše navržených dynamických principů (včetně okolností, za kterých je cyklování aktivátorů pomalé, lešení komplex/prostor podobný svorce není stabilní nebo/i rychlost transkripční reiniciace je nízká) by snižovaly schopnost TA spolehlivě reagovat na vstup (obr. S6).

Předpokládalo se, že vztah vstup/výstup pozorovaný u embryí Drosophily je realizován maximálním využitím limitu molekulárních interakcí37,38,39 . Vlastnosti těchto mikroskopických interakcí jsou integrovány tak, aby se makroskopicky projevily jako SDout. Křivka SDout má ve srovnání s křivkou SDin celkově ještě zvonovitý tvar (srov. obr. 1d). To znamená, že signaturu kódu RTOR lze přímo přenést na výstup. To potvrzuje, že časová míra obsazení aktivátorů je skutečně využívána k regulaci transkripce a mediátor tuto informaci přenáší prostřednictvím alosterie. Na druhé straně je křivka SDout asymetrická, přičemž pravá strana je vyšší než levá. Důvod je zřejmý. Když je vstup velmi vysoký, enhancer je téměř po celou dobu vázán aktivátory, a tak fluktuace odrážejí především dynamické vlastnosti SCF a transkripční reiniciaci Pol II. Naše další simulace ukazují, že pravá strana křivky SDout klesá se zvyšující se stabilitou SCF nebo rychlostí transkripční reiniciace; teprve při zvýšení jejich síly nad fyziologické rozmezí se křivka může stát symetrickou (obr. S6F). Tím se také ověřuje, že P(S) i jsou skutečně dostatečně velké. Vlastnosti SDout by tedy měly přesvědčivě prokázat mikroskopický transkripční mechanismus.

Zatřetí zkoumáme rozložení hladin mRNA ve velké populaci buněk vystavených stejnému vstupu (obr. 3d). U malých vstupů je fenomén prasknutí obzvláště zřejmý a většina buněk nemá žádnou mRNA nebo má jen málo mRNA. To je v souladu s experimentálním pozorováním27,30,31. S rostoucím vstupem se však distribuce postupně normalizuje. Pro aon/aoff >1 se distribuce s rostoucím vstupem stává ostřejší. Tyto výsledky čekají na experimentální identifikaci.

Za čtvrté simulujeme transkripční odezvu na periodicky se měnící vstup. Mikroskopický proces na promotoru je poměrně dynamický a stochastický, přičemž různé složky TA vykazují odlišnou stabilitu (obr. 3e). Množství mRNA však může sledovat vstup. Tyto výsledky jsou v dobrém souladu s výsledky zjištěnými pomocí FRAP, tj. že TA je vysoce dynamický aparát8,10,11,22. Na druhé straně simulace chromatinových imunoprecipitačních testů (ChIP), které charakterizují časový vývoj distribuce různých stavů promotoru mezi buněčnou populací, odhalují silnou pravidelnost v distribucích (obr. 3f). Vzorce vazby aktivátorů na enhancer i vazby SCF a Pol II na promotor sledují vstup. mRNA transkripty jsou produkovány ve fázi se vstupem, zatímco histony obsazují promotor v obrácené fázi. Všechny tyto výsledky dobře odpovídají experimentálním zjištěním22,40. Pozorované rozpory mezi výsledky experimentů FRAP a ChIP proto mohou pocházet z rozdílných rozlišení, která se na měřeních podílejí. Měření ChIP integrují molekulární interakce jak časově, tak v rámci celé buněčné populace, zatímco FRAP těsněji odráží okamžité interakce. Transkripční odezva na časově proměnlivý vstup je navíc robustní vůči vnějšímu šumu, ale citlivá na složené vstupní signály a odchylky od dynamických principů (jako jsou případy s nízkou rychlostí cyklování aktivátorů, nestabilní komplex lešení/prostor podobný svorce nebo/i nízká rychlost transkripční reiniciace) by snižovaly schopnost odezvy (viz obr. S7 a S8).

.